Fyn调控胰腺癌细胞Bcl-X基因选择性剪切分子机制的研究

酪氨酸激酶Fyn与胰腺癌侵袭转移能力密切相关，但具体机制尚不清楚。我们前期研究发现抑制Fyn活性可诱导凋亡相关基因Bcl-X选择性剪切方式改变，促进胰腺癌细胞凋亡；差异量蛋白质组学研究证实Fyn的活性影响结合于Bcl-X上hnRNP A2/B1的表达水平，结合新近研究发现Fyn活性与另一RNA结合蛋白Sam68关系密切的证据，我们提出Fyn通过影响hnRNP A2/B1及Sam68，参与Bcl-X选择性剪切，调控肿瘤细胞凋亡的假说。本项目拟在胰腺癌组织中证实Fyn、hnRNP A2/B1、Sam68及Bcl-X剪切体与肿瘤转移的关系；通过体内外实验，探究Fyn－hnRNP A2/B1-Sam68信号通路在Bcl-X选择性剪切中的作用。通过本研究，以期阐明Fyn调控Bcl-X选择性剪切，参与胰腺癌转移的分子机制，为寻找干预胰腺癌侵袭转移的新靶点提供理论支持。

一、研究背景：.胰腺癌是一种恶性程度很高的恶性肿瘤，发病率在国内外均呈上升趋势。目前认为， 非受体酪氨酸激 Fyn，参与部分肿瘤侵袭转移。然而，尚无Fyn参与胰腺癌侵袭转移的相关研究。Bcl-X能够在不同情况下，经选择性剪切形成两种作用相互拮抗的产物， 然而，Bcl-X基因发生选择性剪切的机制尚不清楚。Fyn通过其蛋白质结构域与下游信号分子结合并发挥作用，实现对靶基因的调控。Fyn可能与RNA结合蛋白之间存在着相互作用。后者通过结合在基因的Pre-mRNA序列上，在转录后水平进行调控。.二、目的.分为两个部分，一是明确Fyn在胰腺癌侵袭转移中的作用；另一方面是探究Fyn是否通过激活其下游靶信号分子hnRNP A2/B1、Sam68参与Bcl-X基因的选择性剪切的调控，并阐明其分子机制。.三、材料与方法.通过免疫组化、Real-Time PCR、放射性同位素P32标记、MTT、Transwell侵袭实验、TUNEL、RT-PCR、2-D gel、RNA-免疫共沉淀技术，构建重组hnRNP A2/B1及hnRNP A2/B1 RNAi腺病毒载体。.四、结果及结论1、Fyn表达水平与胰腺癌侵袭转移密切相关。.2、转染KD-Fyn以后，Fyn激酶活性明显下降。 抑制Fyn活性，抑制了胰腺癌细胞增殖、降低侵袭运动能力，增加凋亡。在裸鼠成瘤实验中，抑制Fyn活性可以明显抑制BxPC3胰腺癌细胞在裸鼠中的成瘤能力。抑制Fyn活性明显改变了凋亡相关基因Bcl-X的选择性剪切方式。.3、Fyn可以结合并调控其下游靶信号分子hnRNP A2/B1的蛋白表达水平及Sam68的磷酸化水平。.4、hnRNP A2/B1的表达与胰腺癌侵袭能力相关。hnRNP A2/B1、Sam68能够与 Bcl-X基因的Pre-mRNA结合。Sam68磷酸化影响与Bcl-X基因的结合能力；而hnRNP A2B1的表达水平影响胰腺癌细胞中Bcl-X两种剪切体的比例。.综合以上实验结果，我们发现了Fyn－hnRNP A2/B1-Sam68－Bcl-X信号通路，即酪氨酸激酶Fyn通过分别结合并影响下游靶蛋白hnRNP A2/B1的表达水平及Sam68的磷酸化水平，参与Bcl-X基因选择性剪切，改变Bcl-X两种功能相互拮抗的剪切体比例，影响细胞凋亡，最终调控胰腺癌侵袭转移。