cel-EⅡB蛋白介导PTS系统对罗非鱼无乳链球菌毒力的影响机制

Streptococcus agalactiae is an important pathogen associated with human, animals and fish. In recent years, it has spread around the world, resulting in great economic losses in Tilapia-industries. Phosphotransferase system (PTS) is regarded as the "nervous system" of bacteria. In our previous studies, the cel-EⅡB protein, an enzyme of cel-PTS, was over expressing in attenuated S. agalactiae strain using proteomics and gene transcription analysis, suggesting that it may be involving in regulating the bacterial virulence. In this research, we plan to evaluate cel-EⅡB protein ediated PTS system in regulating the bacterial virulence with the biological characteristics and virulence changes using gene knockout technology. Base on the method of RT-qPCR and bioinformatics, we tries to testify the cel-EⅡB protein play important role in effecting the gene expression patterns of the PTS metabolic pathways, two signal transduction system (TCS) and virulence proteins. Importantly, this study tries to analyze the molecular mechanisms of cel-EⅡB protein ediated PTS system in regulating of bacterial virulence. Our findings will enrich the theory of the virulence regulation mechanism of Streptococcus agalactiae.

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是重要的人兽鱼共患菌。近年来，罗非鱼无乳链球菌病日益严重，对其产业造成极大的危害。磷酸转移酶系统 (PTS) 在细菌碳水化合物转运和代谢过程中发挥重要作用，被视为细菌“神经系统”。项目组通过蛋白组学和基因转录分析发现：纤维二糖-PTS系统的cel-EⅡB蛋白在无乳链球菌弱毒株中过表达，推测cel-EⅡB蛋白介导PTS系统调控无乳链球菌的毒力。本项目拟采用基因敲除技术，评价无乳链球菌强、弱毒株cel-EⅡB蛋白缺失后其生物学特性变化及其对宿主毒力的影响；通过RT-qPCR与生物信息学的方法，分析cel-EⅡB蛋白对PTS代谢通路基因、二元信号转导系统基因以及下游毒力基因表达的响应，进一步解析cel-EⅡB蛋白介导PTS系统调控细菌毒力的分子机制。本项目的实施将丰富无乳链球菌毒力调控机制研究。

无乳链球菌是重要的人兽鱼共患菌。近年来，罗非鱼无乳链球菌病日益严重，对我国罗非鱼养殖产业造成极大的危害。磷酸转移酶系统(PTS)在细菌的碳水化合物转运和代谢等过程中发挥重要作用，被视为细菌的“神经系统”。 我们在前期研究中发现EⅡB蛋白可能具有负向调控无乳链球菌毒力的功能。本项目以罗非鱼无乳链球菌强毒株THN0901和弱毒株TFJ0901为野生株，通过基因敲除方法无乳链球菌突变株△cel-EIIB和△cel-EIIB::i回补株，发现无乳链球菌强毒株的cel-EIIB基因缺失株、THN0901株生长速率无明显差异，而回补株△cel-EIIB::i生长较迅速，并揭示无乳链球菌△cel-EIIB突变株生物膜形成能力明显低于THN0901野生株，且与△cel-EIIB::i株差异极显著，但弱毒株与相应的cel-EIIB基因缺失株的生物膜形成能力差异不显著。在一定程度内，纤维二糖浓度的添加对无乳链球菌生长具有促进作用，且突变株△cel-EIIB纤维二糖利用显著低于野生株.THN0901和回补株。研究发现，弱毒株的缺失株对宿主细胞的粘附能力强于野生株，而且对斑马鱼的致病力明显强于野生株；而强毒株的回补株在罗非鱼体内的感染能力显著性强于野生株，而突变株对于罗非鱼的感染能力显著性低于野生株。而且低剂量腹腔注射攻毒罗非鱼，突变株致死率（20%）明显低于野生株（53.33%）和回补株致死率（50%）。cel-EIIB基因的缺失可导致PTS系统的celA、manM基因，TCS系统的CiaH、CiaR、DltR基因，以及cspD、cspG、ponA和hylB等毒力基因在强、弱无乳链球菌中呈现相反的表达模式，这是该蛋白调控无乳链球菌毒力分子机制的重要体现。进一步通过比较蛋白质组学筛选出突变株差异表达蛋白质30种，其中能量转换相关蛋白、代谢相关酶类显著性下调（P <0.05）甚至缺失。本项目的实施丰富了无乳链球菌毒力调控机制研究，为研究罗非鱼无乳链球菌致病机理提供新的思路。