一种新型多元均相时间分辨荧光免疫分析方法的建立

通过一次性检测人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)来研究一种新型多元均相时间分辨荧光免疫分析方法的建立。制备出具有光学特异性的三种不同颜色量子点纳米微球和铽螯合物，分别与CEA、AFP 和HBsAg的两株抗体偶联，采用双抗体夹心法模式，充分利用两株抗体与抗原的相互作用，重点研究多色量子点纳米颗粒受体与铽螯合物供体之间的时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)机制，解决获得高效TR-FRET、消除非特异性吸附和受体与供体光谱学等科学技术问题，并从灵敏度、特异度、精密度、稳定性和线性范围等技术指标进行评估优化。该多元均相时间分辨荧光免疫分析方法的最大优势是，在均相中进行检测，不需冲洗掉游离标记物，一次性定性定量分析多个待分析物，为今后实现快速便捷，高灵敏度，微量化及高通量化的现代免疫分析技术提供科学依据。

本项目建立了一种新型多元均相时间分辨荧光免疫分析方法，并成功应用于一次性检测人癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和乙肝表面抗原(HBsAg)，已完成了项目计划书要求的各项内容。制备出具有光学特异性的三种不同颜色量子点纳米微球和铽螯合物，分别与 CEA、AFP 和 HBsAg 的两株抗体偶联，采用双抗体夹心法模式，充分利用两株抗体与抗原的相互作用，重点研究了多色量子点纳米颗粒受体与铽螯合物供体之间的时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)机制。本研究解决了TR-FRET效率问题、消除了非特异性吸附和受体与供体光谱学等科学技术问题，并从灵敏度和线性范围等技术指标进行评估优化。同时，在项目进行中意外发现，铽螯合物的时间分辨荧光的温度敏感性，且可通过更加廉价快捷的处理方式消除量子点纳米颗粒表面的非特异性吸附。针对抗原CEA、AFP 和 HBsAg的检测，我们得到了其工作曲线分别为：其函数分别为：LogY=2.79173+0.91584LogX (R=0.99808)、LogY= 3.69543+ 0.45644 LogX (R= 0.99848) 和 LogY= 4.12898+ 0.40945 LogX (R= 0.99845) ，其中X和Y表示抗原的浓度（ng/ml）和荧光值；并计算其分析灵敏度分别为：0.44、0.24和0.02 ng/mL。对检测影响极大的门控时间也进行研究，发现门控时间大于60 us即可进行分析检测；并通过研究量子点纳米微球的时间分辨荧光衰减，得到了发生时间分辨荧光共振能量转移的直接证据。此外，在研究过程中，也尝试性的探视了与本项目密切相关的其他科学问题。本项目的研究成果发表在专利和论文中。总之，本项目的主要成果是建立了多元均相时间分辨荧光免疫分析方法，在均相中进行检测，不需冲洗掉游离标记物，一次性定性定量分析多个待分析物，为今后实现快速便捷，高灵敏度，微量化及高通量化的现代免疫分析技术提供科学依据。