减毒沙门氏菌介导的RNAi在肝癌治疗中的作用研究

一些治疗肿瘤的RNA干扰药物由基础研究进入临床研究阶段，限制RNA干扰临床应用的一个主要障碍是没有合适的体内靶向释放系统。免疫学研究中已广泛使用减毒沙门氏菌作为载体来运送外源表达质粒。临床研究表明，一些减毒沙门氏菌在肿瘤组织与正常组织的分布比可达25000:1。减毒沙门氏菌能入侵肿瘤细胞、具有良好的肿瘤靶向性和减缓肿瘤生长作用，这预示着沙门氏菌可用于RNAi干扰质粒的靶向运送。.本研究以肝癌细胞为实施例，以本实验室发现的新基因MR-1为靶基因，研究减毒沙门氏菌作为RNAi运送载体的效率，以及在肝癌治疗中的作用。包括： 沙门氏菌体外体内入侵肿瘤细胞能力检测；不同类型RNA干扰质粒的构建；减毒沙门氏菌介导RNA干扰效率检测；携带MR-1基因RNA干扰质粒减毒沙门氏菌对肝癌细胞裸鼠移植瘤的治疗作用等。该研究可以明确减毒沙门氏菌作为RNA干扰释放系统的可行性及效率，为肝癌治疗提供一个新的治疗策略。

核酸的体内转运是核酸药物应用于临床的主要障碍，减毒沙门氏菌因具有良好的肿瘤靶向性，并可以携带质粒，故其可作为载体运载外源表达质粒，但其作为RNA干扰的转运载体的可行性还有待研究。.本研究首先评价了减毒沙门氏菌SL7207体外抗肿瘤活性及机理，并采用荧光素酶标记的方法证明了菌在裸鼠移植瘤模型中具有肿瘤选择性。首先构建了真核干扰质粒，包含U6启动子的shRNA表达盒及真核质粒复制元件，质粒直接转染肝癌细胞HepG2的干扰效率明显，质粒转化SL7207后再感染细胞，尽管免疫荧光实验显示SL7207明显进入了细胞内，但没有明显干扰目的基因的表达。.为了提高干扰效率，我们根据相关文献，采用高效的原核表达系统，即T7 RNA聚合酶/T7启动子，让沙门氏菌来转录产生shRNA。此外，我们还插入了两个文献报导的辅助基因hly和inv，帮助沙门氏菌侵入及在胞内存活。质粒构建完成后对转化SL7207后质粒的各个构建元件的表达均进行了验证。但其对目的基因的干扰效率仍然较低。进一步分析发现干扰RNA在菌体中的表达水平较低，无法达到文献报导水平。.最后我们用携带H1启动子的shRNA表达盒的原核克隆质粒PUC19转化减毒沙门氏菌SL7207，意外的发现其感染肝癌HepG2细胞后可以明显抑制目的基因MR-1的蛋白表达水平。进一步的细胞增殖及转移评价实验中，均发现由于感染菌后，细胞难于长时间维持良好的生长状态，导致携带Mock shRNA表达质粒的菌与携带目的基因MR-1 shRNA表达质粒的菌所产生的效果没有明显区别。进一步的体内裸鼠移植瘤实验表明，与对照组相比，减毒沙门氏菌感染组能够抑制肿瘤生长，但MR-1干扰组与Mock组之间无明显差异，Western blot结果表明MR-1干扰组与Mock组MR-1表达水平无差异。说明这个系统在体内的效果不明显。.综上所述，我们构建并使用了三种不同的干扰RNA表达载体，将其转化减毒沙门氏菌SL7207，并检测了其最终干扰效率。前面两种的体外干扰效果均较差，而第三种的体外干扰效果较好，但在体内没有明显干扰效果。减毒沙门氏菌作为干扰RNA的运载系统还需要进一步的研究。