基于α-芋螺毒素LtIA设计合成α3β2 nAChR特异探针的研究

Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are widely distributed in the central and peripheral nervous system. Accumulating evidence suggests nAChRs play important roles in modulating neurotransmitter release and participating in neurophysiology and pathophysiological processes. They are also implicated in various conditions including nicotine addiction, schizophrenia, Parkinson’s disease, etc. The α3β2 and α6β2* are critical subtypes among nAChRs. Due to the absence of specific ligand that discriminate between α3β2 and α6β2*, selective α3β2 nAChR antagonists in particular, the study of α3β2 nAChR related neurophysiology and pathophysiology was limited. α-Conotoxin LtIA is identified from Conus litteratus native to the South China Sea, which is a potent inhibitor of α3β2 nAChR. However LtIA fails to discriminate the two close subtypes of α3β2 and α6β2* nAChRs. Therefore this project aims to design and synthesis a series of LtIA new mutants according to alanine scanning mutagenesis and their results. Activities of all the LtIA mutants on various nAChR subtypes will be tested by electrophysiology technique systematically in order to find more selective pharmacological probes blocking α3β2 vs.α6β2* nAChRs. At the same time, the molecular insights into the interaction of LtIA with α3β2 nAChR will be analyzed with receptor mutagenesis, toxin-receptor complex crystal structure analysis and molecular docking. The results would provide a basis for developing high specific molecular probe of α3β2 nAChR.

烟碱型乙酰胆碱受体广泛分布于中枢和外周神经系统，参与调控神经递质释放，与许多神经生理和病理生理过程相关，如：尼古丁成瘾、精神分裂症、帕金森病等。α3β2和α6β2*是其中两种重要的亚型。因为缺乏特异区分二者的工具，特别是针对α3β2的特异阻断剂，给α3β2亚型相关神经生理和病理生理的研究带来了困难。从南海信号芋螺中发现的α-芋螺毒素LtIA，是α3β2烟碱型乙酰胆碱受体的强阻断剂，但LtIA不能有效区分α3β2和α6β2*这两种相似亚型。因此，本项目拟通过丙氨酸扫描突变及其结果，设计合成LtIA一系列新突变体，检测突变体的受体结合活性，以期发现对α3β2和α6β2*两种亚型区分度更高的分子探针。同时，通过α3β2受体突变、毒素受体复合物晶体结构解析和分子模拟等多方面研究，阐明LtIA与α3β2受体间相互作用的分子机制，为α3β2烟碱型乙酰胆碱受体高特异性分子探针的开发奠定基础。

α3*（α3*，包含α3亚基） nAChRs 广泛分布于外周和中枢神经系统，其在大脑内侧缰核中大量表达，与恐惧、焦虑、尼古丁成瘾等神经行为密切相关。因此，缰核中的α3* nAChRs也是治疗这些相关疾病的潜在药理学靶标。除此之外，自主神经节中的α3* nAChRs参与调节心血管和肠功能，背根神经节中的α3* nAChR参与痛觉反应。α3亚基与β2亚基一起可以形成α3β2 nAChR亚型，α3β2是与痛觉相关的重要靶点。因此，发现靶向α3β2亚型的特异工具探针，不仅为受体功能的研究提供药理工具，也为新型镇痛药物的研发提供了获选先导化合物。实验室从我国南海信号芋螺中发现的α-芋螺毒素LtIA（α-CTx LtIA）是α3β2 nAChR亚型的有效阻断剂，但同时也对α6β2等其他亚型有一定的阻断效果。因此，本研究重点是基于LtIA进行改造，同时研究它与α3β2 nAChR相互作用的分子机制，基于LtIA开发效果更好的分子探针。本课题综合利用药化化学、电生理、分子生物学、结构生物学、荧光标记等技术。先后获得了LtIA的荧光探针，解析了它与AchBP的共晶结构，阐明了它与α3β2 nAChR相互作用的分子机制；同时基于LtIA进行了设计和改造，获得了专一性更好、活性更强的几个突变体：[A4R]LtIA和[A4S,A6P]LtIA。阐明的分子机制为今后基于α3β2 nAChR设计选择性更好的分子探针提供了基础，荧光多肽和LtIA突变体为今后α3β2 nAChR组织分布、功能和镇痛类药物先导化合物开发提供了更多候选化合物。