植物凝集素基因在棉花中的功能分析

在本项目开展前进行了两年的的前期研究工作，获得半夏凝集素（PTA）和文殊兰凝集素基因(CAA)在烟草叶绿体中高效表达，转基因烟草具有较强的抗虫（蚜虫，烟粉虱，3个鳞翅目害虫），抗细菌和病毒的广谱抗性。本项目中拟将植物来源的有自主知识产权的PTA，CAA基因，分别构建到细胞核转化载体和棉花绿体转化载体，用农杆菌介导的核转化，和基因枪介导的叶绿体转化将外源基因分别导入到棉花核基因组和叶绿体基因组，通过Southern，Northen ，Western杂交，ELISA检测外源基因的整合，转录，表达。利用His-tag技术分离纯化外源凝集素，添加于人工培养基饲喂害虫检测其毒性，结合温室抗虫鉴定，获得抗鳞翅目，蚜虫，烟粉虱等刺吸式口器昆虫的棉花转基因材料。同时检测转化材料对棉花重要真菌，细菌病害的抗性，以其获得广谱抗性的转基因棉花育种材料。比较细胞核和叶绿体转化的植株在遗传，表达等方面差异。

2014年，是全球转基因作物商业化应用第19个年头，对过去20年全球147个已知转基因作物的最新综合分析表明，转基因技术使化学农药的使用率降低了37％，作物产量提高了22%，农民利润增加了68％，预计增加的作物产量的价值为1333亿美元。但随着抗虫棉的大面积推广，抗虫转基因棉也暴露出一些问题，主要表现在以下方面：非BT靶标害虫（盲蝽象，烟粉虱等）危害加剧、BT靶标害虫抗性增强、外源BT蛋白表达稳定性较差，转基因花粉飘移带来的环境安全问题等。. 在这种背景下，本项目拟克隆新型的杀虫蛋白-植物凝集素，利用新的表达系统-叶绿体转化系统，验证这些抗虫基因在植物抗虫基因工程领域的应用前景。.取得的主要进展如下：. 1.利用转录组学的方法，分离鉴定了多个棉花质体，叶绿体发育的顺式调控元件，这些调控元件将用于新型叶绿体转化载体的构建，为今后优化棉花叶绿体转化体系奠定了基础。. 2.利用叶绿体转化的模式材料-烟草，将从药用植物中分离的半夏凝集素（PTA）和文殊兰凝集素基因(CAA)在烟草叶绿体中高效表达，通过Southern、Northern、Western 杂交以及ELISA 检测外源基因的整合，转录，表达。利用His-tag 技术分离纯化外源凝集素，添加于人工培养基饲喂害虫检测其毒性，结合温室抗虫鉴定，发现转基因烟草具有较强的抗虫（蚜虫，烟粉虱，3 个鳞翅目害虫），抗细菌和病毒的广谱抗性。上述结果表明植物凝集素在植物高效表达的体系中，具有广谱的抗虫效果。.3. 根据已经发表的植物凝集素的序列，克隆到了十个植物凝集素基因，并对这些基因的结构特征、分子进化进行了分析，为今后合理利用不同来源的凝集素基因奠定基础。.4. 对原有的棉花叶绿体转化载体进行了优化，主要体现在选择标记基因的改造、5'-和3'-端顺式调控元件的选择等方面，有望提高外源基因在非绿色组织中的表达效率。.5. 完成了10个植物凝集素基因的细胞核转化载体构建及棉花的遗传转化，其中有半数基因的己经获得转基因植株，PCR检测结果表明，90%以上的转基因植物为阳性，说明我们的遗传转化体系非常高效。. 通过本项目的实施成功克隆了多个植物的凝集素基因，并验证了这些基因在叶绿体高效表达体系下对非BT靶标害虫（蚜虫，烟粉虱等）实现有效控制，为今后开发棉花新型抗虫棉奠定了研究基础。