蟋蟀草平脐蠕孢菌蛇孢菌素A合成基因的克隆和功能分析

稗草是全球恶性杂草，也是制约水稻等重要粮食作物产量的主要因素之一。本课题组前期研究发现除草真菌产生的次生代谢产物蛇孢菌素A具有防除稻田稗草和抑制水稻纹枯病菌的作用，而蛇孢菌素族毒素在真菌体内的代谢合成途径以及相关合成基因的研究目前还未见报道。申请人拟以获得的毒素基因插入失活突变菌株为材料，采用TAIL-PCR和RACE技术对蟋蟀草平脐蠕孢菌蛇孢菌素A毒素合成相关基因进行分离和克隆，期望获得一个乃至多个控制蛇孢菌素A毒素合成的相关基因。该项研究将为通过基因调控的方法获得大量表达的有效毒素和遗传改良培育高效工程菌株提供基因资源，促进我国除草微生物菌种的分子育种和微生物除草制剂的产业化。立题思路符合我国关于生态环境安全和农业可持续发展的大目标，且具有明显的新颖性。

稗草是全球恶性杂草，也是制约水稻等重要粮食作物产量的主要因素之一。本课题组前期研究发现除草真菌产生的次生代谢产物ophiobolinA具有防除稻田稗草和抑制水稻纹枯病菌的作用。Ophiobolin族化合物是植物病原真菌产生一类次生代谢产物，它具有广谱的生物活性，能够除草、杀菌、抗肿瘤和杀线虫，因此在农业和医药领域有良好的应用前景。而该类次生代谢产物在真菌体内合成量很低限制其应用。通过克隆毒素基因进而调控真菌代谢途径是一条获得大量毒素的有效途径。但是目前为止Ophiobolin族化合物在真菌体内的代谢合成途径以及相关合成基因的研究还未见报道。因此本项目期望克隆其毒素合成相关基因，后续再通过分子调控的方法获得大量表达的有效毒素而应用。本研究首先对除草微生物蟋蟀草平脐蠕孢菌转录组测序和分析，获知Ophiobolin族化合物合成相关基因的ESTs。在此基础上，采用RACE技术分离和鉴定了4个与该菌Ophiobolin族化合物合成相关的基因BeHMGR、BeFPPS、BeGPPS和BeIPPI。获得其cDNA全长序列，并完成其序列的生物信息学分析。研究表明BeHMGR（GenBank accession No. JQ780844）全长3906 bp，含有一个3474 bp的开放阅读框，编码一个具有1157个氨基酸残基的蛋白，BLASTP分析显示，该基因编码的氨基酸与其它真菌的HMGR有较高相似性。并构建BeHMGR基因阻断载体和表达互补载体，通过转化筛选获得ophiobolin毒素合成插入失活突变菌株及其回复突变子，HPLC分析表明BeHMGR基因功能可能与ophiobolin毒素合成相关。本项目共发表论文4篇，其中两篇SCI。获得专利1项。协助培养研究生3人。其研究成果、实验技术和操作平台的建立为今后其它毒素基因的克隆和功能分析提供技术保证，进而可通过基因调控的方法获得大量表达的有效毒素。也为深入阐明蛇孢菌素生物合成的分子机制奠定了重要基础，为蛇孢菌素的代谢工程提供了更多可能的调控靶点，具有重要的理论意义和应用价值。