水通道蛋白8在降低肝细胞氧化应激抑制胆汁淤积中的作用机制研究

Cholestasis is the pathologic basis of many liver diseases and mechanism is more complicated. Endocytosis plays an important role in cholestasis. It is known that oxidative stress can activate PKC signaling pathway resulted in transporters retrieval from canalicular membrane in cholestasis. However, the regulation mechanism is not clear. We made model of obstructive cholestasis by common bile duct ligated (BDL) in wild type and AQP8 knockout mice and found that early xanthochromia, the down-regulation of Mrp2 transporter protein expression and F-actin rearrangement of canalicular membrane in AQP8 knockout mice following BDL. Moreover, Aquaporin8 (AQP8) can not only transport H2O across cell membrane, but also transport H2O2 to balance in inside and outside cells in various cells. Thus we speculated that AQP8 may be regulated the endocytosis of transporters in mice in cholestasis. Following this hypothesis, we would further study whether if AQP8 would transepithelial transport H2O2 across hepatocytes membrane; if AQP8 would alter H2O2 permeability of hepatocytes membrane; if AQP8 would regulation oxidative stress level in hepatocytes and if AQP8 would stabilize canalicular membrane under cholestasis condition using animal and cell models. We would explicit the mechanism that AQP8 would inhibit the activation of PKC to further prevent the endocytosis of transporters on canalicular membrane. It would provide the new theoretical basis for cholestasis.

氧化应激导致的肝细胞转运蛋白内吞是胆汁淤积的重要原因。高表达于肝细胞毛细胆管膜上的水通道蛋白8（AQP8）是胆汁中H2O转运的重要转运蛋白。最近有研究发现AQP8能够介导白血病细胞内H2O2的动态平衡，提示APQ8有可能参与了胆汁淤积过程中肝细胞的氧化应激的调控。我们前期利用AQP8基因敲除小鼠建立胆汁淤积模型验证这一假设发现：AQP8-/-小鼠皮肤黄染出现早，肝细胞F-actin排列紊乱，肝细胞内ROS含量明显增多,说明AQP8对胆汁淤积的发生发展有抑制作用，其机制可能与氧化应激导致的转运蛋白内吞密切相关。本项目拟从整体和细胞水平系统研究肝细胞内AQP8是否跨膜转运H2O2及其转运具体机制，进而研究AQP8调控转运蛋白内吞的信号通路，阐明AQP8降低氧化应激反应，限制PKC信号通路的激活，减少转运蛋白内吞、抑制胆汁淤积的分子机制，为胆汁淤积的防治提供新的理论依据和治疗的新靶点。

背景：肝细胞的生理功能是形成和分泌胆汁。然而肝细胞之间的紧密连接（TJ）在维持肝脏生理功能中起着至关重要的作用。目前认为，高表达在肝细胞顶质膜上的水通道蛋白8 （AQP8）作为一种水转运蛋白参与了胆汁的形成。但是，AQP8是否参与了肝细胞之间的紧密连接的形成尚不清楚。在本项目中，我们利用AQP8基因敲除（AQP8 KO）小鼠和同背景的野生型小鼠验证AQP8在肝细胞中胆汁形成和维持紧密连接完整性中的作用。结果：AQP8 KO小鼠基础胆汁流量和胆盐刺激后的胆汁流量均明显低于野生型小鼠的。此外，AQP8 KO小鼠在胆盐刺激后，胆汁中总胆汁酸和谷胱甘肽含量升高。分离的小鼠肝细胞对也进一步显示AQP8 KO小鼠胆汁分泌量明显减少。当野生型和AQP8 KO小鼠被执行胆管结扎后（BDL），有趣的发现，AQP8-KO-BDL小鼠较早出现皮肤黄染和非常高的死亡率。血清和肝脏总胆汁酸和胆红素含量明显升高，肝损伤加重。电镜显示AQP8 KO-BDL小鼠肝内胆管扩张、扭曲，不规则，胆管数量减少。此外，AQP8-KO-BDL小鼠的肝脏切片经F-actin和CD10染色后显示，AQP8表达与胆管形态改变有关。然而，AQP8 KO小鼠胆汁淤积的表型与BDL诱导的细胞凋亡、炎症和肝细胞膜蛋白内吞无关。肝细胞膜蛋白表达和定位分析显示，AQP8 KO BDL小鼠中ZO-1、Claudin-1和Claudin表达明显降低，但Claudin-2表达无改变，说明AQP8表达与紧密连接复合物表达下调有关。AQP8-KO-BDL小鼠肝细胞膜上的Caveolin-1表达显著减少，而细胞质中的Caveolin-1表达却显著增加，提示AQP8的表达可能是促进囊泡运输紧密连接蛋白上膜的关键因素。此结果经CoIP实验证实。此外，AQP8敲除并未改变BDL小鼠中与粘附连接相关的β-catenin和E-cadherin的表达。结论：AQP8 KO小鼠在BDL后，胆汁分泌量明显减少，而且细胞骨架排列明显紊乱，胆管破裂导致胆汁淤积性肝损伤。AQP8敲除抑制了囊泡运输紧密连接蛋白上膜，从而增加了毛细胆管的紧密连接通透性，导致胆汁淤积。因此，我们的结果确立了AQP8在肝细胞胆汁形成与分泌，维持毛细胆管的紧密连接稳定中的关键作用。