类胡萝卜素在大肠杆菌细胞中的积累调控

Carotenoids are a class of terpenes of commercial interest that exert important biological functions. While various strategies have been applied to engineer β-carotene production in microbial cell factories, no work has been done to study and improve the storage of hydrophobic terpene products inside their hosts. Although membrane is thought to be the cell compartment that accumulating hydrophobic terpenes, such as β-carotene, there seems to be no direct evidence. In this work, we aim to engineer and change the properties of cell membrane, membrane synthesis pathway and cell morphological of Escherichia coli, which is to study the relationship betweenβ-carotene accumulation and cell membrane properties, and even to improve cell storage capacity for β-carotene. With associated methods and technologies, such as electron microscopy and membrane separation technology, we will be able to illustrate the mechanism to control accumulation of β-carotene in cells. This research opened up a new direction for engineering microbial terpene producers, and even for other hydrophobic products.

萜类化合物有很好的医疗保健功效。构建微生物细胞工厂合成萜类化合物是国内外的研究热点。改造大肠杆菌生产萜类化合物的研究主要集中在途径改造方面，其在大肠杆菌中积累和转运报道很少。虽然有研究显示萜类化合物可能和细胞膜结合，积累在膜附近区域，但还没有对萜类化合物在细胞内的积累机制有深入研究和明确结论。我们推测细胞膜的形态和组成对萜类化合物积累有很大影响。另外，细胞形态会影响细胞膜形态，从而间接影响萜类化合物的积累。本项目拟对产β-胡萝卜素大肠杆菌工程菌的细胞膜形态、细胞膜合成和细胞形态这三大功能模块进行改造，研究其与细胞膜含量及β-胡萝卜素产量之间的相互关系，并通过电镜、细胞膜分离等手段阐明β-胡萝卜素在大肠杆菌细胞内的积累方式。以此为基础对细胞膜进行系统改造，从产物积累角度提高大肠杆菌合成萜类化合物的能力。本研究将为创建高产疏水化合物的细胞工厂提供全新思路和改造策略。

类胡萝卜素（Carotenoids）是一类具有良好生理活性以及营养功能的天然的脂溶性色素。本研究以产β-胡萝卜素、番茄红素或虾青素的大肠杆菌为研究对象，通过改造大肠杆菌的细胞膜提高细胞中类胡萝卜素的积累从而提高产量。.目前研究推测类胡萝卜素储存于细胞膜上，单位细胞中细胞膜的含量可能会显著影响类胡萝卜素的积累程度。本项目通过过表达来自 Acholeplasma laidlawii的脂糖基转移酶基因Almgs改变膜结构，高表达膜合成途径关键基因增加细胞膜量，从而提高提高细胞对β-胡萝卜素的承载能力，提高β-胡萝卜素产量。所得菌株CAR015-37Almgs(pPlsBC)的β-胡萝卜素产量达到19.6 mg/g DCW，比出发菌株CAR015产量提升了约2.9倍。这种膜改造策略分别用于高产β-胡萝卜素菌株CAR025、产番茄红素的YL101和虾青素高产菌株Ast007中，单位细胞β-胡萝卜素产量提高了49.4%；番茄红素和虾青素单位细胞产量分别提高了32%和60%。.另外本项目利用将虾青素合成途径关键酶分别用与膜蛋白或者dCas9蛋白融合的策略，将CrtZ和CrtW蛋白定位在膜上，在空间上拉近底物与酶的距离，加快催化速度。结果表明两种策略使虾青素产量分别提高了215.4%和26.7%。.据报道，革兰氏阴性菌在某些环境中可以分泌外膜囊泡。我们重建了天然OMV系统，建立了一种新型的人工膜囊泡转运系统（AMVTS），并将其引入大肠杆菌细胞工厂，以高效分泌β-胡萝卜素。敲除tolA, tolR以及nlpI等编码与外膜形成相关蛋白的基因，可以增加外膜囊泡的量，使外排β-胡萝卜素的量显著提高。然后，组合敲除tolA和nlpi并共表达与膜合成相关的AccABCD与PlsBC，所得菌株TW-013(pAcc,pPlsBC)胞外β-胡萝卜素的量比对照菌株菌株CAR015增加了53倍（从0.2 到10.7 mg/g DCW）；β-胡萝卜素总量提高了3.2倍（从6.9到21.8 mg/g DCW）。.综上所述，本项目围绕膜工程改造大肠杆菌，达到提高类胡萝卜素积累与产量的目的。从改造细胞膜形态，加强细胞膜合成途径，以及构建外排系统三个方面进行了深入的研究，为提高类胡萝卜素及其它疏水化合物产量提供新的研究方向。