钠离子/牛磺胆酸共转运多肽NTCP和乙肝病毒表面PreS1多肽特异性相互作用的分子机制研究

Hepatitis B virus (HBV) is a serious threat to human health. Sodium/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP, SLC10A1) mediates the entry of HBV into hepatocytes through specific binding with the PreS1 peptide on HBV envelope. NTCP is the functional receptor for HBV infection and a potential target for anti-HBV drugs. However, the molecular mechanism of interaction between NTCP and PreS1 is still unclear. Our previous study showed that NTCP localized on the cellular membrane of Sf9 cells and significantly bind to PreS1-FITC peptide. In this project, NTCP recombinant protein and surface plasmon resonance (SPR) technology will be used, together with NTCP homology modeling and point mutation analysis, to reveal the factors that affect the binding affinity of NTCP to PreS1 peptide at molecular level, such as binding affinity, key binding residues of NTCP, oligomerization of NTCP, and so on, in order to explain the interaction mechanism between NTCP and HBV PreS1 peptide. The results of this study can provide important information for designing drugs that blocking HBV infection from NTCP, and further structural biology study for NTCP.

乙肝病毒（HBV）严重危害人类健康，而钠离子/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP，SLC10A1），通过与乙肝病毒表面PreS1多肽特异性结合，介导HBV进入细胞感染肝脏，是HBV感染的功能性肝细胞受体，也是抗HBV药物的潜在靶标，但两者相互作用的分子机制尚不十分明确。我们前期实验结果表明，在Sf9细胞中，NTCP定位在细胞内膜上，可显著结合PreS1-FITC多肽。本项目拟使用NTCP重组蛋白和表面等离子共振技术，结合NTCP同源模建和点突变分析，从分子层面揭示可能影响NTCP与PreS1多肽结合的因素，如结合亲和力、NTCP关键结合残基、NTCP聚集状态等，以期阐释NTCP与乙肝病毒PreS1多肽相互作用的机理。本研究结果可为针对NTCP与PreS1多肽的相互作用设计阻断乙肝病毒感染的抑制剂提供重要依据，并为NTCP结构生物学研究奠定基础。

乙肝病毒（HBV）严重危害人类健康，而钠离子/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP，SLC10A1），通过与乙肝病毒表面PreS1多肽特异性结合，介导HBV进入细胞感染肝脏，是HBV感染的功能性肝细胞受体，也是抗HBV药物的潜在靶标。.我们使用Bac-to-Bac杆状病毒系统感染Sf9昆虫细胞表达了MBP-NTCP重组蛋白。经过细胞膜组分分离和表面活性剂提取，使用亲和层析获得了MBP-NTCP重组蛋白。进一步使用PreScission酶对MBP-NTCP重组蛋白进行酶切，通过体积排阻色谱分析，最终获得了纯度较高的NTCP重组蛋白。.通过抗体间接偶联的方法，我们将NTCP重组蛋白固定在表面等离子共振（SPR）实验芯片上。对NTCP配体进行动力学分析，拟合得出乙肝病毒PreS1多肽对NTCP结合的平衡解离常数KD为4.93 μmol/L；NTCP经典底物牛磺胆酸钠对NTCP的平衡解离常数KD为25.3 μmol/L。相对于化合物抑制NTCP底物转运的活性，通过SPR方法测得的平衡解离常数可同时比较化合物与NTCP直接相互作用力的强弱，并用于研发基于NTCP-PreS1相互作用的抗HBV药物。.我们建立了定量的荧光共振能量转移（FRET）方法用于分析NTCP在Sf9细胞中的二聚化。我们发现在东亚人群中占比最高的单核苷酸多态性S267F突变可显著降低NTCP同源和异源二聚体的FRET效率，显示该突变可改变NTCP二聚化结构状态。而NTCP C端的截短突变对FRET效率影响较小。荧光体积排阻色谱分析（FSEC）显示，在DDM/CHS表面活性剂提取溶液中，荧光蛋白标记的NTCP可能存在多种聚集状态。