两栖动物适应高海拔生境的分子基础——基于抗氧化多肽组学的新探索

The genetic basis of adaptation to high-elevation life have been well characterized for many species, however, little is known for amphibians, besides, the information provided by proteomic or peptidomic basis is little known. In order to investigate the molecular basis of amphibians' skins to adaptation the UV-exposure surroundings, we chose a pair of amphibians: Odorrana andersonii and O. wuchuanensis, the former frog lived in high-altitude surroundings with extensive UV exposure; but, in contrast, the latter frog live in cave and without any lights. Based on this observation, we assumed their skin antioxidant peptide (AOP) systems should differ in many aspects. Through the combinational methods of peptidomics, genomics and functional annotations, we found the the AOPs' diversity of O. andersonii is much higher than that of O. wuchuanensis. This program is aiming to compare the difference of skin antioxidant peptides between the high-altitude and caved amphibians in the following aspects: diversity, structure, types of posttranslational modifications and antioxidant activities. Furthermore, in order to elucidate the molecular basis of their antioxidant activities, the research on the relationship of structure-function will be performed. In all, this program will provide novel clues of peptidomics to understand molecular basis of amphibians' adaptation to high-elevation life, besides, novel templates with property rights for the explore of new antioxidants will be provided.

目前，生物适应高海拔的分子机制一直是国际上的一个研究热点，但鲜有研究报道尝试从蛋白质/多肽组学差异层面进行探索。在前期的工作中，我们选取了一对臭蛙姐妹物种：云南臭蛙和务川臭蛙，二者的生境有一个非常明显的差异：前者生活在高海拔生境中，紫外照射强烈，而后者却是洞穴物种，无光照。因此，我们推测在环境压力的驱使下，二者皮肤中抗氧化多肽在多方面必然存在较大差异。我们通过分离纯化技术，初步发现云南臭蛙皮肤抗氧化多肽丰度要远远大于务川臭蛙。本项目旨在通过多肽组学结合基因组学、功能蛋白质组学手段，比较云南臭蛙和务川臭蛙皮肤中的抗氧化多肽在丰度、结构、翻译后修饰类型及抗氧化活性方面的不同，同时，研究其结构-功能关系，阐明其抗氧化的分子基础，最终为理解物种适应高海拔生境的分子基础提供多肽组学层面的线索，同时为我国新型抗氧化剂的开发提供具有自主知识产权的先导分子。

阐明生物高海拔适应的分子机制一直是近年来生命科学的热点研究领域。然而目前动物适应高海拔环境的策略和生理生化机理研究主要集中于低氧低温适应，而对动物如何抵御高原强紫外线辐射的认识非常有限。且鲜有报道尝试着从不同物种蛋白质组学/多肽组学的差异性这个角度来解释生物的高海拔适应机制。云南臭蛙（Odorrana andersonii）分布于海拔2500 米左右的高原地带，而穴居的务川臭蛙(Odorrana wuchuanensis)在生活史中很少受到强紫外辐射的影响，项目选取了这一对臭蛙姐妹物种，研究了二者对强紫外照射的分子适应机制。研究发现在正常情况下没有紫外线刺激时，云南臭蛙和务川臭蛙皮肤分泌非常少量的多肽/蛋白。然而在紫外辐射后二者分泌的抗氧化多肽均增加，尽管这些多肽的分子量均小于4000 Da，质谱分析显示这些多肽具有丰富的分子多样性。与务川臭蛙（约40种多肽分子）相比，云南臭蛙分泌的抗氧化肽（超过100种多肽分子）呈现出更大的分子多样性、高效的自由基清除活性和抗氧化能力以保护动物免受紫外线引起的组织损害。研究结果提示云南臭蛙进化形成了一个强大、复杂的皮肤抗氧化肽产生系统以抵御高原强紫外线辐射。从而揭示了高原分布的两栖动物适应高海拔强紫外环境的生物策略和分子基础。 .同时，我们从云南臭蛙皮肤分泌物中纯化并鉴定了一个新颖的cathelicidin分子，命名为cathelicidin-OA1。与其他cathelicidin不同，cathelicidin-OA1没有直接的杀菌作用以及急性毒性和溶血活性，但有抗氧化活性。体外划痕实验表明抗氧化肽cathelicidin-OA1通过加速人表皮角质细胞（HaCaT）的增殖和皮肤成纤维细胞（HSF）的游走从而促进伤口愈合，并呈时间和浓度依赖关系,并且在促创伤修复的过程中还发挥免疫调节作用。尤其值得关注的是，cathelicidin-OA1在皮肤损伤修复小鼠动物模型中同样能通过加快巨噬细胞在创口处的招募、加速HaCaT及HSF的增殖和迁移从而加快上皮组织重建和肉芽组织的形成进而促进伤口的愈合。这也是两栖动物中鉴定得到的第一个具有伤口愈合活性的cathelicidin。该研究不仅为新型创伤修复药物的研发提供新思路，也有助于我们对cathelicidin生物功能的理解。