派琴虫调控宿主防御机能的分子机制研究

鉴于目前我国派琴虫病流行及危害的严峻形势，在前期我国东部海域养殖贝类感染派琴虫病流行病学调查、休眠孢子培养及分子鉴定的基础上，建立奥尔森派琴虫营养孢子的体外培养和分离方法；借助抑制消减杂交（SSH）技术，研究在培养基中添加宿主组织D对派琴虫营养孢子基因转录水平的调控情况，并筛选出差异表达基因（ESTs）；借助荧光PCR定量技术，对差异表达基因的受调控情况进行定量分析，BLAST分析筛选出高度差异表达基因中与调控宿主防御机能相关的3-5个基因并进行3'RACE扩增和体外表达；以宿主血淋巴中的溶菌酶、凝集素作为监测指标，研究在饲料中添加表达蛋白对宿主非特异性免疫机能的影响，并通过体内实验观察表达蛋白对宿主防御派琴虫入侵的调控作用。派琴虫调控宿主防御机能的分子机理研究，是研究寄生虫与宿主互作的重要途径，可望从分子水平上阐明派琴虫入侵及感染的机理，从而为派琴虫疫苗的研制及药物研究开辟新的途径。

鉴于目前我国派琴虫病流行及危害的严峻形势，为从分子水平上探索派琴虫入侵与感染的机理，本研究开展了派琴虫调控宿主防御机能的分子机制研究。首先建立并比较了奥尔森派琴虫休眠孢子起源及营养孢子起源的两种体外培养方法，并借助研究建立的原位杂交及LAMP技术对培养的派琴虫进行鉴定；结果表明休眠孢子培养虫体含量过低，营养孢子起源的直接培养虫体含量可达108个/微升，适于后续研究使用。利用蛤组织成分刺激体外培养的派琴虫，借助抑制消减杂交技术，建立了宿主调控派琴虫基因差异表达的cDNA文库，并借助southern-blot技术及序列在线BLAST分析，筛选出了差异表达基因61个；借助荧光PCR技术，对差异文库中筛选的MOE基因进行了定量分析，结果表明MOE基因在受宿主成分刺激后产生高丰度表达。为研究派琴虫调控宿主防御机能的机制，本研究制备了MOE单克隆抗体，利用抗体对体外培养的虫体进行孵育后人工感染实验动物，结果实验动物死亡率明显降低，表明派琴虫通过表达MOE成分，在派琴虫感染宿主的过程中起调控作用。研究表明，在感染宿主后，奥尔森派琴虫通过提高自身MOE基因表达量来参与宿主相互作用，提高病原体的感染力和防御宿主的机能。本课题按原计划开展了研究工作，达到了预期的研究目的。