嗜热厌氧杆菌中精氨酸阻遏蛋白（ArgR）调控木糖代谢的机制研究

Co-utilization of hexoses and pentoses derived from lignocellulose is one of the key factors for economic ethanol production in industrial scale. Arginine repressor (ArgR）was identified as a global transcriptional regulator with multiple function and found as a negative regulator on xylose metabolism in Thermoanaerobacterium aotearoense under mixed substrates of glucose and xylose. Analysis of ChIP-seq will be used for exploring the transcriptional regulatory site of ArgR on the whole genome, then regulon will be constructed and comprehensive elucidation of the causal relationships between ArgR and genes will be obtained by integrated analysis of expression data. The regulatory mechanisms of ArgR on glucose and xylose utilization in this strain will be explored. Based on it, high efficient metabolic engineering to improve substrate uptake, especially xylose utilization, will be achieved for higher ethanol yield and productivity and it has important theoretical significance and value in industrial application on strain development of bioethanol-producing microorganisms.

己糖（葡萄糖）和戊糖（木糖）能被乙醇发酵微生物共利用是决定植物纤维资源生产生物乙醇经济可行的关键因素之一。精氨酸阻遏蛋白（ArgR）是一个全局性的转录调控因子，前期研究发现嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense）在混合糖（葡萄糖和木糖）为底物时ArgR为木糖代谢的负调控因子。本项目拟通过免疫共沉淀偶联测序（ChIP-seq）技术并结合生物信息学分析，确定ArgR在全基因组序列上的调控位点，构建ArgR与基因互作的精细网络图，然后通过基因敲除或过表达，验证与ArgR结合位点基因的功能，解析ArgR调控葡萄糖和木糖代谢的机制。基于此，以提高底物尤其是木糖利用效率为目标对该菌进行有效的代谢工程改造，从而提高乙醇产量及产率，对于纤维素生物能源微生物的分子育种有较高的理论价值和应用前景。

工业菌株葡萄糖和木糖共利用的特性在廉价生物质转化中具有重要应用价值。课题组前期对Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27在不同碳源及不同时间段的转录组测序及数据分析，挖掘到精氨酸阻遏蛋白（Arginine repressor，ArgR）基因argR1864。与SCUT27相比，SCUT27/ΔargR1864木糖利用速率、葡萄糖利用速率和乙醇浓度均显著提升。以木糖为碳源对SCUT27/∆argR1864进行转录组数据分析，结果表明，ArgR1864具有全局性转录调控功能，是精氨酸代谢相关基因和热激蛋白相关基因表达的负调控因子，还能通过转录后调控木糖和乳酸代谢相关酶的活性。通过Dap-seq在全基因组上挖掘，结果表明argR1864可能与碳代谢、磷酸吡哆醛代谢和细胞膜代谢等模块相关。同时凝胶阻滞实验也证明ArgR1864通过直接调控未知功能基因2014、1833和1057的表达，其中1833利于精氨酸的合成；1057为潜在的木糖ABC转运子；而2014为未知功能基因。成功构建Type I-B CRISPR系统，并利用该系统对多个靶基因进行功能验证，结果表明敲除未知功能基因2014，工程菌的木糖利用速率及乙醇生产能力分别提高37.49%和191.68%；rex敲除后，底物利用能力提高74.19%-130.56%且乙醇得率增加63.16%-88.23%；在SCUT27/Δldh中敲除metJ后，20 mg/L甲硫氨酸外源添加条件下，与SCUT27/Δldh相比，工程菌的总糖耗速率及乙醇产量均提高15%；pflA的敲除，使乙醇产量提高49.02%，葡萄糖利用能力提高44.21%；同时通过遗传改造获得SCUT27/ΔcelR/PadhE和SCUT27Δldh::scrBA，分别赋予SCUT27葡萄糖和纤维二糖共利用能力以及蔗糖利用能力。