SEMA4A蛋白通过调节RhoGTPase活性而促进巨噬细胞迁移和结核肉芽肿形成的机制研究

Macrophage migration is very essential in the formation of tuberculous granuloma, which was a typical feature of tuberculosis. SEMA4A protein can promote the migration of macrophages, but the mechanism is unknown. Our previous study found that: (1) the level of SEMA4A protein in plasma of tuberculosis children with was higher than control, implying the effects of this protein in MTB infection; (2) the level of SEMA4A protein was significantly increased in vitro model culture of macrophages and tuberculous granuloma, implying the effects of this protein in tuberculous granuloma formation; (3) bioinformatics analysis indicated that SEMA4A could affect the activity of Rho GTPase by through the receptors of Plexin B1. Therefore, we assumed that the SEMA4A protein might influent macrophage migration and the formation of tuberculosis granuloma by Rho GTPase. In this study, we investigate the receptor and Rho GTPase activity regulation factor (GEF) of SEMA4A protein in macrophage. By GEF genes covering and target protein gene knock out, we further analysis the mechanism of SEMA4A protein on macrophage migration and tuberculous granuloma formation. Our study will provide new data on the understanding of tuberculous granuloma formation.

结核性肉芽肿是决定结核感染转归的重要因素，巨噬细胞迁移是肉芽肿其形成的首要环节，SEMA4A蛋白可促进巨噬细胞迁移但机制不明。前期发现，(1)结核患儿血浆SEMA4A蛋白升高；(2)SEMA4A蛋白在结核性肉芽肿细胞中表达升高，与结核性肉芽肿相关；(3)生物信息学分析提示SEMA4A可作用Plexin B和Plexin D受体影响Rho GTPase活性，因此提出SEMA4A蛋白可通过Rho GTPase影响巨噬细胞迁移和结核性肉芽肿形成的假说。利用已建立的结核性肉芽肿模型，拟通过tranwell和染色等分析SEMA4A蛋白对巨噬细胞迁移和结核性肉芽肿形成的影响；通过Co-IP和RNA-seq筛选SEMA4A蛋白作用受体及Rho GTPase调节因子(GEF)；通过GEF基因回补及敲除，分析Rho GTPase活性、巨噬细胞迁移和结核性肉芽肿变化，为研究结核性肉芽肿形成机制提供重要数据。

结核病(Tuberculosis, TB) 是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 感染引起的慢性传染病。巨噬细胞在宿主抵御MTB 感染中发挥了至关重要的作用，但其抗MTB机制尚不明确。免疫信号素SEMA4A 是SEMA家族中具有免疫调节功能的一种信号素，又被称为“免疫信号素”，在感染性疾病中研究有限。项目组研究发现：（1）血浆蛋白质组学结果显示，结果显示，TB患儿血浆中的SEMA4A蛋白的表达水平明年高于健康对照。（2）巨噬细胞可能是TB患者血浆表达水平升高的主要来源之一。用MTB感染的小鼠骨髓来源巨噬细胞中（BMDM），随着感染时间延长，SEMA4A的RNA表达水平的明显升高。用MTB感染THP1细胞，SEMA4A无论在转录水平和蛋白水平均明显升高；免疫荧光结果显示，MTB刺激可引起SEMA4A蛋白表达升高，主要分布于胞浆和细胞膜表面，呈现聚集高表达现象；（3）MTB感染引起的SEMA4A升高可能是由NF-κB通路介导的。荧光素酶报告基因实验显示，SEMA4A上游启动子序列有NF-κB的结合位点；MTB刺激后，同时加入NF-κB的抑制剂，可以明显拮抗MTB感染引起的SEMA4A表达上调；（4）高表达的SEMA4A可能对巨噬细胞的迁移产生影响。SEMA4A可促进巨噬细胞迁移，且迁移是通过巨噬细胞表面的Plexin D1介导的。随着SEMA4A刺激浓度的升高，大量趋化因子，如CCR7，CCL5，CXCL16等表达明显升高，提示SEMA4A可通过PlexinD1受体相互作用，进而影响趋化因子的表达，促进巨噬细胞迁移。本研究通过阐明SEMA4A对巨噬细胞迁移的影响及机制，对深入理解巨噬细胞通过SEMA4A参与抗MTB感染过程具有重要作用，未来可针对SEMA4A或者下游Plexin D1设计药物靶点，将有可能为TB治疗提供新的方向。