致病性大肠杆菌胁迫下的蚯蚓-微生物协同防御及分子机制

蚯蚓仅有天然免疫性，不能以特异性免疫机制防御外来侵染物。那么蚯蚓是如何成功地防御强毒性的病原微生物的呢？本课题以高致病性的肠出血性大肠杆菌E.coli O157:H7作为胁迫因子，研究赤子爱胜蚓体表屏障、体腔液细胞等固有免疫系统在抵御O157:H7胁迫中的作用；采用变性梯度凝胶电泳技术分析O157:H7胁迫下肠道微生物区系变化，探讨蚯蚓肠道微生物在蚯蚓协同防御O157:H7中的作用。利用抑制消减杂交、转录组测序、双向电泳结合MALDI-TOF/TOF-MS、同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术筛选鉴定蚯蚓防御O157:H7的免疫相关基因和蛋白，结合定量PCR和Western Blot的方法，从基因和蛋白水平揭示蚯蚓应对O157:H7的免疫应答与分子机制。其研究结果有望揭示无脊椎动物的抗病与生态免疫的机理，并为高致病性病原微生物控制提供新的途径。

蚯蚓作为环节动物门寡毛纲的代表物种，具有非常强大的免疫能力。前期的研究工作中，我们发现蚯蚓可以抵御致病菌E.coli O157:H7的高浓度胁迫，它自身的免疫功能主要通过体表屏障、细胞和体液等固有免疫系统来实现。. 在本项目中，我们对蚯蚓体壁、肠壁的组织和细胞的免疫机理进行了研究，发现蚯蚓的皮肤主要通过角质层的加厚、分泌物的增加以及溶酶体和过氧化物酶体的增多等来实现对致病菌的防御；同时，致病菌E.coli O157:H7的胁迫会导致肠道上皮细胞脱落、纵肌层收缩、微绒毛数量减少和细胞线粒体内膜损伤、空泡化，还有细胞染色质的凝集或边聚，细胞核消失。通过对胁迫下差异基因的研究，我们发现蚯蚓在应对不同程度的致病菌胁迫时，具有不同的免疫策略；蚯蚓的免疫过程主要涉及催化活性、细胞代谢和信号转导等 12个方面的功能；我们还发现，在不同浓度的致病菌胁迫下，蚯蚓的炎症反应通路中的关联基因V-ATPase、CTSK和CTSL的显著下调，溶酶体通路中ATPeV基因的显著上调。. 我们还发现，在抵御致病菌胁迫的过程中，除了蚯蚓自身的免疫系统发挥作用，蚯蚓肠道中的土著菌群也协助宿主对致病菌进行了防御。在E.coli O157:H7进入肠道之前，蚯蚓的嗉囔和砂囊可以通过物理研磨作用非常显著减少它的数量（两个数量级）；当E.coli O157:H7进入肠道后，由于蚯蚓肠道中微生物群落的内稳态机制的存在，使得肠道中E.coli O157:H7的数量保持在一个相对稳定的水平，从而达到了协助蚯蚓防御致病菌的作用。. 蚯蚓肠道菌群协助宿主进行免疫的机理的提出，为研究高等生物肠道菌群的协同免疫作用提供了新的思路和理论依据。致病菌胁迫下的蚯蚓差异转录组学研究的结果与生物学研究的结果相吻合，可以在分子水平上对蚯蚓自身免疫机理的研究提供参考。蚯蚓的炎症反应通路中的三个关联基因（V-ATPase、CTSK和CTSL）如何在自身免疫反应中发挥作用，还需要进一步的研究。