大肠杆菌O157粘附因子基因的表达及功能研究

大肠杆菌O157是威胁食品安全的动物源性病原菌。最近，我们用转座子TnphoA插入失活试验，发现该菌的ycbR、ycbQ和Z4182基因与其对HEp-2细胞的粘附现象有关。本研究项目将根据上述基因的核苷酸序列，设计合成寡核苷酸引物，用PCR方法从该菌中扩增出这三个基因，将其克隆到适当的表达载体，表达并纯化表达产物，用表达产物免疫兔子，制备抗血清，提取和纯化免疫球蛋白。培养大肠杆菌O157，热抽提法分离纯化其菌毛，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色观察，并做western blotting，确认这三个基因的表达产物是否为菌毛。通过甘露糖抗性血凝试验，鉴定大肠杆菌O157 产生的菌毛是否为I型菌毛。用上述制备的抗血清做血凝抑制试验，分析大肠杆菌O157的血凝作用是否有特异性抑制作用。通过以上试验，阐明上述三个基因的产物与大肠杆菌O157粘附现象之间的关系，为食品检验提供理论依据。

大肠杆菌O157:H7（以下简称为大肠杆菌O157）是威胁食品安全的传染性病原菌，感染可致腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等疾病。在大肠杆菌O157的致病过程中，粘附是重要的环节，但对于其粘附现象现在的认识很不全面。本研究小组前期利用转座子TnphoA插入失活试验，发现该菌的ycbR、ycbQ和Z4182基因与其对HEp-2细胞的粘附现象有关。本研究根据上述三个基因的核苷酸序列，设计合成寡核苷酸引物，用PCR方法从该菌中扩增出其基因，克隆到适当的表达载体，表达并纯化表达产物，用表达产物免疫兔子，制备抗血清，进而利用抗血清进行体外粘附阻断实验，以阐明这些基因与粘附现象之间的关系。. 根据大肠杆菌O157 ycbR基因设计表达引物，分别在上下游引物中加入了Nco I和Xho I的酶切位点，从大肠杆菌O157基因组中扩增ycbR基因，将目的基因连接T载体，转入大肠杆菌DH5α中，转化子用PCR、酶切和测序方法进行鉴定。测序结果与GenBank已报道的相关序列比较，表明二者有很高的同源性。用限制性内切酶Nco I、Xho I分别双酶切T-ycbR阳性重组质粒和pET-28α表达载体，连接并转入表达宿主大肠杆菌BL21，成功构建了ycbR原核表达系统。2L发酵罐发酵培养并诱导表达得到包涵体形式的蛋白，经镍柱分离纯化获得带组氨酸标签的重组蛋白，表达量约占菌体蛋白的56%。大肠杆菌O157 Z4182基因按照相似的方法克隆，其表达量占菌体蛋白51%。将纯化后得到的两种基因表达产物分别皮下注射免疫不同的兔子，制备抗血清。由于ycbQ性质的原因未克隆到其基因。. 用间接ELISA法测定抗血清的抗体效价和敏感度，并利用上述制备的抗血清进行的粘附阻断试验，结果表明，加入不同浓度的抗血清可以不同程度地抑制大肠杆菌O157对HEp-2细胞的粘附现象，当加入的抗血清剂量足够高时，甚至导致粘附现象消失。. 本研究克隆并表达了大肠杆菌O157 粘附基因，利用基因工程表达产物制备的抗血清可以抑制其对上皮细胞的粘附作用，对阐明大肠杆菌O157的致病机理，从而为开展预防和治疗提供了科学依据。