Pact在胚胎期小鼠外耳软骨膜CSPCs凋亡中的作用机制

Seed cells (CSPCs) in the outer ear cartilage have mesenchymal stem cell properties. Sustained reduction in the number of CSPCs leads to slowing of cartilage growth. When the apoptosis of CSPCs in the outer ear of the embryo declines, the sustainable growth of the cartilage appears as a giant ear. Pact gene is involved in early embryonic development and apoptosis, and Pact - / - mice exhibit small ear deformities in their outer ear cartilage. Pact has been identified as susceptible genes in patients with microtia, but its mechanism is unclear. We think that Pact regulates the number of CSPCs in the outer ear perichondrium through apoptosis, which leads to the occurrence of small ear deformity. To verify the hypothesis, the following studies were carried out: (1) To compare the numbers of CSPCs in the external auricular peritoneum at different developmental stages of wild-type (Pact + / +) and Pact - / - mouse embryos; (2)The outer ear cartilage membrane apoptosis-related factor expression; (3) Using apoptosis inducing agent in wild-type mouse embryos, Pact - / - mice using apoptosis inhibitor to observe the development of the outer ear. Through the above studies, we hope to elucidate the mechanism of action of Pact in apoptosis of CSPCs in the outer ear perichondrium in embryonic mice.

外耳软骨膜中的种子细胞（CSPCs）具有间充质干细胞特性。CSPCs数目持续减少导致软骨生长渐缓，当胚胎期外耳CSPCs凋亡减弱时，软骨可持续生长表现为巨耳。Pact基因参与了早期胚胎发育及细胞凋亡，且Pact-/-小鼠外耳软骨发育迟缓表现为小耳畸形，前期工作已明确Pact为小耳畸形患者易感基因，但其机制尚不清楚。我们认为Pact通过凋亡作用调控胚胎期小鼠外耳软骨膜CSPCs数目，其数目异常降低导致小耳畸形的发生。为了验证该假说，进行以下研究：①比较野生型（Pact+/+）和Pact-/-小鼠胚胎不同发育时期外耳软骨膜CSPCs数目；②比较野生型和Pact-/-小鼠胚胎不同发育时期外耳软骨膜凋亡相关因子的表达；③在野生型小鼠胚胎期使用细胞凋亡诱导剂，Pact-/-小鼠使用细胞凋亡抑制剂，观察外耳发育情况。通过以上研究，期望阐明Pact在胚胎期小鼠外耳软骨膜CSPCs凋亡中的作用机制。

小耳畸形是耳科的最常见畸形，表现为出生后耳廓形态异常，多伴发外耳道狭窄或闭锁、中耳结构改变，其致病基因尚未明确。外耳软骨膜中的种子细胞（CSPCs）具有间充质干细胞特性。Pact基因参与了早期胚胎发育及细胞凋亡，且Pact-/-小鼠外耳软骨发育迟缓表现为小耳畸形。我们认为Pact通过凋亡作用调控胚胎期小鼠外耳软骨膜CSPCs数目，其数目异常降低导致小耳畸形的发生。本项目首先建立小耳畸形生物样本库（全血、畸形耳组织、皮肤、肋软骨、患者亲属全血）并开展致病基因研究，已收集小耳畸形患者及正常对照的血液、残耳软骨等样本3000余例，建立小耳畸形样本资源库。其次构建Pact基因敲除小鼠模型（KOAIS191111HX1-Prkra-Cas9基因敲除小鼠），采用Cas9技术敲除Pact基因exon8，KO（Knock out）杂合互配出生64只，获得43只杂合子，但无纯合子出生，进行RT-qPCR和拷贝数检测，可以确定exon8已成功敲除。杂合小鼠取3.5d胚胎检测确实有KO纯合子，从目前数据及打靶方案分析，本项目的KO鼠算真正意义上的KO鼠。文献方案中的KO鼠，mRNA分析残留一个hybrid mRNA，虽然Western Blot检测没有目的蛋白，但残留mRNA产生的蛋白会产生怎样的功能未知。结合胚胎检测数据，确定Pact敲除纯合无法获得活体小鼠。运用转录学和蛋白组学，单细胞测序等方法研究先天性耳畸形软骨样本以及正常软骨组织样本，寻找细胞亚群上的差异，明确其致病机制。开展耳廓软骨组织细胞类型和功能的解析，发现耳廓软骨的软骨层中能存在从未报道的软骨前体/干性细胞（CSPCs），且具有定向软骨分化的潜能，可能是耳廓软骨组织工程更优的种子细胞，通过单细胞转录组测序揭示了耳廓软骨组织存在七种软骨相关的细胞亚群，分属两个发育谱系，提出软骨干/前体细胞中转录因子的失调在小耳畸形发病中的重要作用及可能的分子机制。本项目新发现的CSPCs有望为耳廓软骨组织工程研究提供更优的种子细胞，在组织工程耳再造等领域进行转化。