改性果胶结合半乳糖凝集素GAL-3的结构基础及其机制

Modified pectin (MP) possessing specific structural features can bind to human Galectin-3 (GAL-3), resulting in beneficial bio-functions such as prevention of cancer and metastasis. However, the problem “What structural feature shall be required for binding to GAL-3?" is in debate, because of the complexity of pectin structure, the influence of source, extraction and modification on pectin structure and the most important, lacking of an effective method for screening the active MPs which can bind to GAL-3. This project is aiming to establish such a screening method, thereby proposing the structural features for binding GAL-3. Outline of research content includes: (1) Immobilization of GAL-3 in appropriate gel matrix via electrostatic absorption for screening active MP molecules; (2)preparation of MPs from natural sunflower low-methoxyl pectin, screening active MPs from the prepared MPs using immobilized GAL-3 method, characterization of active MP and proposing their structural features; (3) Simulation on the binding of MPs to carbohydrate recognize domain (CRD) in GAL-3 by quantum chemistry method and comparing the difference in binding way of MPs with different structure.

具有特定结构特征的改性果胶（MP）能与人半乳糖凝集素Galectin-3（GAL-3）相互结合，起到降低癌症发生、抑制癌细胞扩散等生理效果。由于改性果胶结构组成复杂，且受到来源、提取方式、结构修饰方法的影响，同时还没有建立一种筛选能与GAL-3结合的MP的有效方法，所以“具有何种特定结构特征的活性MP能与GAL-3结合”仍是一个有争议的学术难题。本项目拟建立一种筛选活性MP方法，并尝试提出其结构特征共性。研究内容包括：（1）利用静电吸附作用将GAL-3固定化在凝胶上并制成凝胶柱，进一步用于特异性结合活性MP分子；（2）以实验室自制的向日葵盘天然低甲氧基果胶为原料制备MP，用GAL-3凝胶柱从中筛选活性MP，并根据所得活性MP结构表征结果提出结构特征共性；（3）利用量子化学理论模拟手段模拟活性MP与GAL-3上糖识别区（CRD）相互作用机制，比较不同结构片段与GAL-3的结合方式。

果胶是一种天然的多糖大分子，其结构多样，不同来源的果胶具有不同的结构，且通过各种生物化学反应可以改变果胶的分子量、酯化度、毛发区含量等结构特征，从而改变果胶的性质。特别地，具有特定结构的果胶或果胶降解产物，在动物体内表现出结合半乳糖凝集素的活性，可以抑制半乳糖凝集素参与肿瘤细胞迁移。本课题从果胶结构入手，系统研究了果胶的结构表征方法、提高酯化度的酯化反应方法、降低酯化度的脱酯化方法，以及相应的分子量变化，进一步探讨了不同结构下果胶的本征粘度、凝胶特性等主要理化性质；再此基础上，采用高浓度酸水解、超滤脱盐、酶二次水解的方法制备了小分子果胶片段，并通过离子交换色谱分离收集了不同结构特点的果胶片段，然后基于ELISA原理建立了快速且微克级的果胶结合人半乳糖凝集素比色检测法。用分子模拟手段模拟对比了不同果胶结构片段及乳糖与人半乳糖凝集素-3（GAL-3）的碳水化合物识别区（CRD）的相互作用强弱。研究发现：（1）可以通过非水相酯化反应制备得到酯化度90%以上、分子量10~15 kDa的高甲氧基果胶，其具有良好的溶解性和表面活性，可以用于制备粒径300~500nm的乳液；（2）通过碱脱酯或酶脱酯可以制备酯化度10~30%之间的低酯果胶，碱法产物分子量明显下降且酶法产物分子量基本不降解，其本征粘度凝胶亦相应减少或增大，脱酯果胶凝胶所需的Ca离子浓度和pH值也产生相应变化；（3）通过连续水解后柱层析分离得到5个不同果胶结构片段（RG区含量依次降低而HG区含量依次升高），ELISA法检测发现，5个片段均表现出结合GAL-3的活力，且随RG区含量减少，结合能力下降，果胶结合GAL-3的能力与果胶浓度的对数值呈线性关系，而ELISA法中的包被条件对检测结果无明显影响；分子模拟研究结果现实，HG区、RG区（GalA-Rha交替片段）、寡聚半乳糖及乳糖分子能在不同位置与GAL-3的CRD区通过氢键结合，结合能力随GalA含量的增加依次减少，与实验结果一致，但天然底物乳糖仍然是结合能力最强的分子。