帕金森病特异性血清miRNA的筛选、鉴定

帕金森病的诊断缺乏有效可靠的生物学指标。小样本研究表明帕金森病患者血清中存在microRNA的差异性表达。我们推测帕金森病患者血清中存在特异性的microRNA表达谱，这种特异性的血清microRNA表达谱有可能成为帕金森病的诊断标志物。本研究通过高通量、高灵敏度的Solexa测序技术分析帕金森病患者和正常对照血清中目前已知的1366种microRNA的表达，从中筛选出帕金森病特异性的血清microRNA；通过实时荧光定量PCR技术检测帕金森病特异性的血清microRNA在帕金森病患者及正常对照血清中的含量，探讨其作为帕金森病临床诊断生物学指标的可行性、特异性及灵敏性，为帕金森病的早期快速诊断提供新的方法及技术支撑。本研究将筛选出新的帕金森病标志物，还将为帕金森病发生、发展的理论及寻找治疗靶点提供新的内容。

方法：收集了106例散发性PD患者血清和115例年龄/性别匹配的健康人血清。首先运用Solexa测序技术检测了15例PD患者和15例健康人分别组成的两份混合血清中1223种miRNAs的表达量，初步筛选出PD组与control组相比显著差异表达的miRNAs。然后运用实时荧光定量PCR技术（quantitive real-time PCR, qRT-PCR）分两步在不同的样本量中验证初筛的miRNAs。通过复筛组（45例PD和36例control），验证组（61例PD和79例 control）的验证，以获得在PD患者中显著差异表达的一组血清miRNAs。最后通过ROC曲线、聚类分析等评价其临床诊断价值。.结果：Solexa测序发现，PD组和control组混合血清分别能够检测到159种和138种miRNAs，初筛了15种miRNAs进入验证阶段。运用qRT-PCR技术对复筛组检测后发现这15种miRNAs中有5种miRNAs（miR-195，miR-185，miR-15b，miR-221，miR-181a）在患者血清中的表达与健康人血清有显著差异；验证组进一步证实了复筛组的结果。根据临床cut off值，计算了5种血清miRNAs的灵敏性和特异性，分别是：miR-195为50% 和69%，miR-185为60% 和 77%，miR-221为64% 和81%，miR-15b为66% 和 82%，miR-181a为50%和77%。聚类分析结果显示复筛组中41例PD患者和32例健康人能够被正确分开，正确划分率为91.1%和88.9%，而验证组中52例PD患者能够被正确分开，正确划分率为85.2%。表明这5种miRNAs具有成为临床诊断标志物的潜质。.结论：PD患者和健康人血清中存在丰富而稳定的各种miRNAs，患者血清miRNA表达谱与正常人的具有显著差异；我们发现PD患者血清中miR-195显著上调，而miR-185，miR-15b，miR-221，miR-181a显著下调；分析表明这5种miRNAs的组合能够作为潜在的血清标志物进行PD诊断。