过表达基因FADD抑制视网膜神经节细胞程序性坏死的机制研究

Glaucoma is a blinding disease that is characterized by programmed cell death of retinal ganglion cells (RGCs) and axons damage. As reported, necroptosis is tightly related to RGCs and their axons damage and gene FADD is involved in the regulation of necroptosis. Our recent study found that RGCs death could be classified as apoptosis and necroptosis in vivo and in vitro and overexpression of FADD could significantly ameliorate the RGCs necroptosis through inhibiting the interaction of RIPK1 and RIPK3. Based on above, this project will further explore the relationship among necroptosis, RGCs survival and their axons regeneration, the mechanism of FADD expression on RGCs necroptosis, and the correlation between FADD signal pathway and glaucoma occurrence. Moreover, to study the regulatory elements which influence gene FADD expression, we will focus on the upstream microRNA of this target gene. To elucidate the molecular mechanism of FADD anti-necroptosis, we would focus on two signal pathway: AKT and Sarm1-MAPK, through molecular biology, cell biology and visual electrophysiology techniques in animals, cells and patients. To observe the effect of gene FADD on RGCs necroptosis，gene FADD will be overexpressed, and the expression of RIPK1, RIPK3, MLKL and so on, will be detected. We will observe the effect when necroptosis was inhibited and provide a new therapeutic target for the prevention of RGCs damage.

青光眼是一类以视网膜神经节细胞（RGCs）程序性死亡及轴突损伤为特征的疾病，已有研究表明，程序性坏死与RGCs的死亡及轴突损伤密切相关，基因FADD参与细胞的程序性坏死过程。我们最近的研究发现，在体内和体外模型中，RGCs和视网膜神经细胞的死亡方式可表现为凋亡和程序性坏死两种形式，且过表达基因FADD可通过抑制RIPK1和RIPK3的相互作用来显著减轻细胞程序性坏死的发生比例。本项目将在该发现的基础上进一步探讨程序性坏死与RGCs存活状态及轴突生长的关系，阐明基因FADD影响RGCs程序性坏死发生的相关机制，明确基因FADD表达水平及其上下游信号通路与原发性青光眼的相关性。我们将运用分子生物学、细胞生物学和视觉电生理等技术，从AKT和Sarm1-MAPK两个信号通路入手，从动物、细胞和患者三个方面全面探讨过表达基因FADD抑制RGCs程序性坏死发生的机制，为今后RGCs的保护提供科学依据。

青光眼是一类以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）程序性死亡及轴突损伤为特征的疾病，涉及三条主要信号转导通路的凋亡一度被认为 RGCs程序性死亡的唯一形式。近年来，基因、生化方面的多项证据显示，除凋亡这种死亡形式以外，细胞的死亡过程还包括程序性坏死。程序性坏死的提出及相应分子机制的研究，强调了青光眼等眼病治疗在拮抗凋亡的同时抑制程序性坏死进程的重要性。本研究旨在了解程序性坏死与RGCs生存之间的关系，掌握过表达基因FADD抑制程序性坏死发生的机制。我们已顺利完成本课题相关的全部实验内容，发现如下：体外培养的视网膜前体细胞系（R28）中确定程序性坏死的存在；C57BL6/J小鼠的视神经钳夹损伤模型中，存在RGCs和无长突细胞（amacrine cells, ACs）的程序性坏死；FADD过表达可有效抑制RGCs及ACs坏死且提升RGCs存活数目；与此同时，体外及体内模型中证明了miRNA761可在不影响FADD mRNA表达的情况下通过转录后调控方式影响FADD蛋白表达，抑制其活性能够有效降低RGCs坏死率且提高RGCs细胞存活数目；成功鉴定能够有效调节miR761-FADD信号通路的lncRNA-NR_045396，体内研究显示NR_045396过表达可有效抑制RGCs及ACs坏死且提升RGCs存活数目。此外，我们在此课题基础上通过结合对间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）相关非编码RNA （non-coding RNAs, ncRNAs）的检测，进一步探究了MSCs相关ncRNA对外源性再生抑制微环境的改善及对视神经再生的促进作用，该研究已成功获得国家自然科学基金面上项目的资助（项目编号82070967）。该项目从体内和体外模型中取得的研究进展及关键结论，深入全面地展示NR_045396、miRNA-761参与的过表达FADD抑制RGCs程序性坏死发生的机制，且充分探究了直接作用于基因FADD的上游ncRNAs分子，有利于直接定位FADD 的转录后调控靶点，具有从临床应用的角度提供抑制RGCs程序性坏死促进视神经再生的治疗靶点的潜能，为今后的RGCs细胞保护治疗提供了有力的科学依据。