植物激素乙烯及茉莉酸通路中转录因子DNA复合物的结构与功能研究

Many plant hormones play very important roles in plant physiological processes such as growth, development, reproduction, senescence and resistance to environmental stresses. Research activities related to the plant hormone signaling pathways have been very active recent decades. A number of novel pathways with many new proteins molecules have been discovered and identified related to plant hormones signaling, and many of these molecules are specific to plants. The structural studies of these proteins with their complexes with nuclear acids, or with other protein partners will reveal new mechanistic insights about the plant hormone function and their evolutionary aspects. The detailed understanding of the function of the plant hormones will further promote their application in agricultural fields. This research proposal presented here sets the goal to study the structure and function of two important transcription factors in Arabidopsis thaliana, EIN3 and MYC2 which are master controllers in the ethylene and Jasmonate signal transduction pathways respectively. We plan to solve the crystal structures of the complexes of these two families of proteins (different truncations or full length) with their cognate DNA sequences by co-crystallization and/or CryoEM techniques, and with necessary functional experiments, trying to understand the regulation and interaction mechanisms of proteins within the ethylene and Jasmonate signal transduction pathways.

植物激素在植物的生长、发育、繁殖、衰老以及抵抗环境压力过程中发挥着十分重要的作用，对于植物特有激素的相关信号传导通路的研究近年来非常活跃，鉴定出了很多新型信号传导通路及相关蛋白分子，许多蛋白分子是植物中所特有的，对于这些生物大分子及其复合物的结构研究将揭示新的机理及生物大分子演化规律，从而进一步理解这些激素的功能并进而促进它们在农业上的应用。 本申请希望通过对拟南芥中两类具有相互交叉功能的重要激素，乙烯及茉莉酸（Jasmonate, JA）信号传导通路中的转录因子EIN3及MYC2 家族及其相应DNA复合物的结构与功能研究，解析不同功能结构域蛋白-DNA的复合物晶体结构，并且尝试结晶或者利用CryoEM解析其全长复合物结构，结合功能实验，对乙烯和茉莉酸信号通路及其相互作用进行深入系统的研究。

乙烯及茉莉酸（Jasmonate, JA）是两种非常重要的植物合成激素，在植物发育、生长、成熟及抵抗外界环境压力等方面发挥重要作用，乙烯及JA信号传导通路中的转录因子EIN3及MYC2 家族是执行功能的关键，其相应DNA-蛋白复合物的结构与功能研究至关重要，在基金委资助下，我们解析了EIN3及MYC2的不同功能结构域蛋白-DNA的复合物晶体结构，结合功能实验，对乙烯和茉莉酸信号通路及其相互作用进行深入系统的研究，提出了新的理论模型，在国际学术刊物上发表了五篇相关文章。.在拟南芥中，目前已确定的茉莉酸信号通路的转录因子有MYC2、MYC3和MYC4，它们属于bHLH转录因子家族，拥有相似的蛋白质序列和结构组成，研究表明它们均可调控茉莉酸通路的基因表达且功能类似。.另一方面该家族蛋白的DNA序列选择性究竟是怎样的，目前仍不清楚。对于MYC2的DNA序列选择性的研究也显示出与之前哺乳动物bHLH蛋白的研究结果存有差异。由于相关蛋白结构信息的缺乏，这种差异的机制至今不明。.基于上述情况，我们大量表达并纯化了MYC2的bHLH结构域蛋白，通过X射线晶体学的方法解析了2.7Å分辨率的MYC2-bHLH蛋白和G-box DNA的复合体结构。该结构显示，两个MYC2二聚体结合形成四聚体，同时结合两条DNA双螺旋链。该结构一方面说明了MYC2是通过453位的组氨酸来识别8bp的DNA序列‘NCACGTGN’，同时也解释了MYC2识别‘AACGTG’以及‘CATGTG’这两种高亲和性序列的分子机制。.我们的复合物结构同时揭示了MYC2形成二聚体和四聚体的分子机制。结合静态光散射和凝胶过滤层析等方法，我们确认了MYC2在溶液中以及和DNA结合状态下都以四聚体状态存在，但是MYC3却只能形成二聚体。利用ITC和SPR实验，我们证明了MYC2比MYC3有着更强的DNA结合能力。通过各种突变体实验，我们进一步证明了四聚化是增强DNA结合能力的原因。最后，通过FRET实验，我们证明MYC2可以同时结合一条DNA双链上的两个位点来促使形成DNA looping的结构。经过多年不懈努力，我们也解析了EIN3-DBD及其 DNA 复合物的高分辨率晶体结构，正在进行功能验证及文章准备过程中。