基于5S rRNA的黑曲霉CRISPR-Cas9高效多位点无痕基因组编辑系统研究

Aspergillus niger is a very important industrial workhouse used for the production of organic acids, industrial enzymes and pharmaceutical proteins. Lack of efficient genetic manipulation tools dramatically restricts the full exploitation of its industrial potential. As a new generation of genome editing technology, CRISPR-Cas9 system brings a revolutionary breakthrough in targeted genome modification for many organisms. The adaption of CRISPR-Cas9 for A. niger was also tried but inefficient. The major technical obstacle is the lack of generally applicable sgRNA expression approach, and all the examples reported were tested to be less efficient in A. niger. In the previous study, we at the first time proposed to use well-recognized 5S rRNA for the sgRNA expression, in which the gene disruption frequency reached up to nearly 100%. Based on this invention, the project will further develop a rapid marker-free CRISPR-Cas9 system in combination with dual selection markers, marker-free donor DNA and NHEJ temporarily deficient chassis. Moreover, we will further optimize the targeting site, length of homology arm of the donor DNA and the ratio of sgRNA and donor DNA to establish a standardized protocol for highly efficient multiple gene targeting. The invention of this versatile CRISPR-Cas9 system for A. niger will greatly facilitate fundamental study and development of cell factory in A. niger.

黑曲霉是有机酸、工业用酶与医药蛋白的重要生产菌株，但缺乏高效遗传操作工具导致其生产潜能的开发利用受到严重制约。CRISPR-Cas9系统作为新一代基因组编辑技术，为多种生物基因组定向改造与调控带来革命性突破。有报道尝试在黑曲霉中建立CRISPR-Cas9系统，但效率相对较低。其关键难题是真核生物中缺乏普适性的sgRNA高效表达方法。我们首次提出以5S rRNA基因为启动子起始sgRNA的表达，实验证实其引导Cas9对黑曲霉基因组定点切割效率可达100%。以此为基础，本项目将借助双向筛选标记的使用、供体DNA的无痕设计与NHEJ暂时性失活的结合，建立黑曲霉无痕基因组编辑技术；并进一步优化靶序列的选择、多基因sgRNA比例、供体DNA同源臂长度与用量等实现多基因多位点的快速编辑，总结形成黑曲霉基因组编辑的推荐方法，大幅降低黑曲霉基因编辑难度，为推动黑曲霉基础研究和工业菌种改造提供重要技术支撑。

黑曲霉是重要工业生产菌株，广泛用于有机酸与酶制剂的生产。黑曲霉具有极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性、高食品安全性等优势，使其成为不可多得的细胞工厂。但黑曲霉高效遗传操作工具的匮乏，不仅阻碍了其基础研究工作的开展，也大大限制了黑曲霉潜能的开发与利用。近年来，基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术以操作简单、靶向特异、编辑高效、通用性广的优势在不同物种得以广泛应用。但在真核生物中，sgRNA高效表达策略的缺乏大大制约了CRISPR/Cas9系统的开发和应用。针对这一问题，本项目首次提出以5S rRNA启动子起始sgRNA表达的策略，并以此建立了基于CRISPR/Cas9系统的黑曲霉高效基因组编辑工具体系。本项目发现5S rRNA启动子可显著提高sgRNA的表达丰度，引导Cas9蛋白靶向特定基因位点进行切割，从而使基于NHEJ系统的基因失活效率达100%。为进一步提高基因精准编辑效率，本项目发现以NHEJ暂时性失活菌株为底盘细胞，含有40 bp短同源臂的供体DNA即可实现效率达100%的高效精准基因插入编辑；本项目提出了“Two-Cuts”的基因精准敲除策略，结合NHEJ暂时失活利用一次基因组编辑即可实现长至48 kb的基因簇敲除；利用引入碱基插入、碱基突变与碱基丢失的无痕供体DNA，可有效实现对特定位点的精准碱基无痕编辑。在技术应用开发方面，本项目进一步建立了利用双向筛选标记的无痕多位点循环编辑技术和结合Tet-on系统的启动子原位替换技术，并应用于黑曲霉柠檬酸底盘菌株的构建与黑曲霉菌球形态控制基因的功能研究。综上所述，本项目建立的基于5S rRNA-CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术工具包与标准化技术流程，可实现黑曲霉单位点或多位点的基因插入、基因敲除、碱基编辑以及基于启动子替换的基因表达调控等不同需求的基因组编辑，使基因组编辑周期缩短至两周，为黑曲霉细胞工厂的设计改造与分子基础研究提供了完善的合成生物学使能技术工具包。同时，本项目首创的5S rRNA启动子起始sgRNA转录的策略可成功解决sgRNA高效表达的难题，为真核生物CRISPR/Cas基因组编辑技术的建立和应用提供了新的研究思路。