基于抗病毒蛋白SAMHD1的HIV与宿主细胞间博弈的新分子机制研究

SAMHD1 is a cellular protein playing key roles in the innate immune system, which potently and specifically inhibits infection of blood cells by a wide range of retroviruses including HIV-1. SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase (dNTPase) and also specifically binds to single stranded (ss) RNA and ssDNA. Despite intensive investigation, the mechanism for viral restriction by SAMHD1 still remains unclear and controversial. HIV has evolved to antagonize SAMHD1 by utilizing host factors to down-regulate SAMHD1 and escape the immune response. The overall goal of the proposed research is to establish the biochemical and structural basis by which SAMHD1 inhibits retroviral infection and HIV antagonizes the restriction by SAMHD1. We aim to delineate the molecular mechanism and cellular function of the HIV-induced degradation of SAMHD1 and the nucleic acid binding activity of SAMHD1. To achieve this goal, we will use a combination of techniques including biochemistry, structural biology, virology and immunology to delineate the mechanisms of the regulation of SAMHD1 during viral invasion and non-infected condition and further elucidate the relevance of each biochemical activity in its antiviral and other cellular functions. We will determine the crystal structures of SAMHD1 in complex with degradation partners and with ssRNA/ssDNA, and validate the structural observations. We will perform structural-guided mutagenesis to design mutants with decoupled dNTPase and nucleic acid binding. We will identify the ssRNA/ssDNA binding sites to facilitate the design of such mutants and to advance the mechanistic understanding of the multiple activities of SAMHD1. The mutants will be verified in our in vitro assays and used in cellular viral restriction assays to assess their relevance to the antiviral activity of SAMHD1. A complete understanding of the regulation and modulation of the biochemical activities of SAMHD1 in HIV restriction is crucial for assessing its potential as a therapeutic target for AIDS.

SAMHD1是宿主天然免疫系统中的抗病毒蛋白质，可以特异性高效拦截包括HIV-1在内的多种逆转录病毒。它具有脱氧核苷酸磷酸水解酶（dNTPase）活性，还可以特异性结合单链RNA和单链DNA。然而SAMHD1的抗病毒分子机制至今未明，仍然存在广泛争议。HIV进化出独特机制拮抗SAMHD1的抗病毒功能，利用宿主系统降解SAMHD1，逃避先天性免疫反应。本项目将就SAMHD1抗HIV感染的分子机理与病毒拮抗SAMHD1的分子机制展开研究，以SAMHD1在细胞内被降解调节的分子机制以及SAMHD1和核酸的相互作用为研究起点和突破口，综合运用生物化学、结构生物学、免疫学和病毒学等多学科交叉的方式，全面揭示SAMHD1抗病毒的精确作用机制，以及机体面对病毒入侵和正常生理状态下不同的调节机制，为利用天然免疫反应开发抗病毒新疗法和基于“病毒-宿主”相互作用开发全新抗病毒药物奠定理论基础。

SAMHD1（Sterile alpha motif and histidine-aspartate domain containing protein 1）作为一种先天性免疫应答中的病毒抑制因子，可以抑制包括HIV-1在内的多种逆转录病毒的复制。然而SAMHD1的抗病毒分子机制至今未明，仍然存在广泛争议。SAMHD1具有脱氧核苷酸磷酸水解酶（dNTPase）活性，还可以特异性结合单链核酸。前期研究显示SAMHD1的dNTPase活性部分阐释了它的抗病毒活性机制，但还存在其他的抗病毒机制待阐明。SAMHD1的核酸结合性质可能是研究其抗病毒分子机制的潜在方向。HIV进化出诱发SAMHD1降解的独特机制以拮抗SAMHD1的抗病毒功能。前期研究表明细胞周期蛋白Cyclin L2与SAMHD1直接相互作用并通过CRL-DCAF1-E3泛素连接酶和蛋白酶体对SAMHD1完成降解，但Cyclin L2、SAMHD1和E3泛素连接酶相互作用的精确机制还未揭晓。本项目就SAMHD1抗HIV感染的分子机理与病毒拮抗SAMHD1的分子机制展开研究，以SAMHD1在细胞内被降解调节的分子机制以及SAMHD1和核酸的相互作用为研究起点和突破口，综合运用生物化学、结构生物学等多学科交叉的方式，探究SAMHD1抗病毒的精确作用机制，以及机体面对病毒入侵和正常生理状态下不同的调节机制。在本项目中，我们利用外源蛋白质表达系统获得SAMHD1、Cyclin L2、DCAF1等蛋白质及其各种截短体，并通过拉下实验和分子筛凝胶层析方法检测了SAMHD1、Cyclin L2和DCAF1之间的相互作用。同时，我们使用不同方法检测了SAMHD1与核酸之间的相互作用并成功制备了稳定的SAMHD1-核酸复合物，并深入探究了SAMHD1核酸复合物的聚集状态、酶学活性及其与dNTPs诱导形成的活性四聚体之间的酶学活性比较，发现了一种动力学上稳定的SAMHD1-ssDNA复合物。此外，我们从晶体学和冷冻电镜技术两方面入手，对于SAMHD1-核酸复合物的结构基础进行了深入探索与尝试。我们的工作深入探究了SAMHD1和核酸相互作用的性质以及Cyclin L2-SAMHD1-DCAF1相互作用，补充了当前SAMHD1与核酸相互作用的模型，进一步拓展了我们对SAMHD1的核酸结合性质的了解。