EMD对BMSCs细胞膜片在钛种植体表面骨再生的效应与机制研究

Effective solutions to complex bone defects that ensure adequate healthy bone tissue around the titanium implant are urgently needed in dental implant treatment. Bone tissue engineering represents an alternative method with prospects for application in the clinic.However, it remains unclear whether bone tissue engineering with cell sheets can achieve an osteogenic effect on the titanium implant surface similar to autologous bone. Our previous study demonstrated that osteoblast cell sheets showed a strong osteogenic capability in vitro. The current study will apply enamel matrix derivative (EMD) at different concentrations and reaction times to bone marrow stromal cells (BMSCs) sheets on the titanium implant surface and assess the effect of EMD on the osteogenesis of BMSCs sheets by morphology, cytochemistry, RT-PCR, and Western blotting. The expression levels of β-catenin, osteoprotegerin (OPG), and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) will be compared before and after treatment with the Wnt antagonist DKK1, to analyze whether EMD affects the osteogenesis of BMSCs sheets on the titanium implant surface through the canonical Wnt signaling pathway and to explore its regulatory mechanism. An animal model of bone defects around titanium implants (e.g., the one wall and two walls bone defect) will be established, and the bone regeneration process was evaluated for bone defect treated with EMD and BMSC sheets. hard tissue sections and micro computed tomography (micro-CT) will be performed to observe the ability of EMD/BMSC sheets to repair bone defects around the titanium implants and to investigate the effect of bone tissue engineering with EMD/BMSC sheets on bone regeneration on the titanium implant surface.

有效应对各种骨缺损，确保钛种植体周围有足够骨组织，是口腔种植亟需解决的问题。骨组织工程是具有应用前景的处理方法。能否通过细胞膜片骨组织工程在钛种植体表面获得类似自体骨的成骨效果？课题组在前期工作中证实，成骨细胞膜片具有较强的体外成骨能力。本研究拟对钛种植体表面的BMSCs细胞膜片施加不同浓度和时间的EMD，通过细胞化学、RT-PCR、 Western Blot等，观测EMD对其成骨性的影响；加入Wnt拮抗剂DKK1，对比β-catenin、OPG、RANKL等表达变化，分析EMD是否通过Wnt信号通路影响钛种植体表面BMSCs细胞膜片的成骨效应 ，探讨其调控机制。构建骨缺损动物模型，采用EMD与BMSCs细胞膜片等进行骨再生处理，通过硬组织切片、Micro-CT等方法，观察其对钛种植体周围骨缺损的修复能力，探讨EMD/BMSCs细胞膜片骨组织工程在钛种植体表面骨再生的效应。

【摘要】目的：骨组织工程技术修复口腔骨缺损是具有应用前景的可能临床治疗替代方法，间充质干细胞因其具有多向分化的潜能而被认为是骨组织工程理想的种子细胞。釉基质衍生物（EMD，Emdogain）因其具有牙周膜再生的潜能已被广泛应用于牙周重建的治疗，而EMD对BMSCs影响及作用机制仍存争议。为了研究在组织工程方面生物制剂发挥的辅助作用及其影响机制，本项目初步探索EMD对BMSCs体内外成骨分化的影响及其可能作用机制。方法：体外分离培养SD大鼠骨髓间充干细胞并进行细胞鉴定；扫描电镜观察三种不同表面处理的钛表面形貌特征；在不同浓度和作用时间下，分别采用免疫荧光、茜素红染色、qRT-PCR、Western blot等方法检测EMD作用于不同钛表面BMSCs细胞膜片的成骨相关因子的表达；加入Wnt经典通路抑制剂xav939，检测转录因子β-catenin及成骨相关基因Runx2、Osterix、ALP、COL1、OCN mRNA的表达；在裸鼠体内植入BMSCs细胞膜片/钛片复合体，4周后组织学观测体内成骨效应。结果：体外培养细胞鉴定证实为BMSCs；25μg/ml EMD作用于不同钛表面BMSCs细胞膜片，阳极氧化钛表面组成骨相关因子的表达最显著；加入xav939后，β-catenin及成骨相关基因的相对表达量均下降，当EMD浓度分别为0、5、10、15、20、25 μg/ml时，Western blot检测结果显示，β-catenin的表达水平随着EMD浓度增加而增加，且在此浓度范围内呈现浓度依赖性。动物实验HE染色结果提示，实验组发现紫蓝色块状不成熟骨组织，对照组无骨组织形成。结论：EMD对BMSCs早期和晚期成骨标志物的影响呈现促进作用，在三种不同表面处理的纯钛表面，EMD对阳极氧化钛表面BMSCs膜片成骨分化的促进作用最为显著。EMD对钛表面BMSCs的成骨分化作用可能通过Wnt/β-catenin信号通路进行介导。本研究的结果提示，EMD/BMSCs细胞膜片可能为钛种植体周骨缺损治疗提供一定的骨组织工程治疗思路，为寻找口腔种植领域骨再生有效的干细胞治疗方法提供一定的实验研究基础，有关的影响因素及其具体作用机制还有待进一步的深入研究。