诊断海洋病原微生物的多通道磁性“化学鼻”传感机制研究与验证

Infectious diseases are common in the ocean, and here we tabulate examples that can reduce commercial species' growth and survivorship or decrease seafood quality.The project is to utilize multi-channel magnetic “chemical nose” system, which can be used to rapidly detect target microorganisms with functionalized nanomaterials for marine aquatic diseases. This is a new way to realize mariculture disease protection based on “chemical nose” system. It will be a new research in the field of nano-biosensor. The aim of this project is to solve the key scientific problems, pattern-generating response of chemical nose for specifically pathogenic diagnosis. A new mechanism for the rapid diagnosis of pathogenic microorganisms based on multi-channel magnetic “chemical nose” system was proposed. This research will provide theoretical and experimental basis for the development of marine aquaculture disease prevention technology, which is of great significance to improve the system in nano- biosensor related theory and rapid diagnosis of marine aquatic disease.

本项目拟利用四种荧光蛋白与功能化磁性材料组装成多通道磁性“化学鼻”，用其快速诊断海洋环境中病原微生物，达到海水病害微生物防护的目的。这是基于多通道磁性“化学鼻”实现海洋病害微生物防护的一个新的途径和机制，也将是纳米生物传感器领域中一项新的研究和探讨。本项目拟解决多通道磁性“化学鼻”对海洋环境病原微生物选择性识别和响应这个关键科学问题，进而设计制备有利于海洋病原微生物快速诊断的磁性“化学鼻”探针技术和方法；提出基于多通道磁性“化学鼻”快速诊断病原微生物新机制；揭示多通道磁性“化学鼻”在海洋病害微生物快速诊断中应用的可行性及适用条件，该研究的开展对于完善磁性“化学鼻”的纳米生物传感器相关理论以及海洋病害微生物快速诊断有重要意义。

“化学鼻”是一种具有选择性和交叉反应性的列阵传感器已经被用于各类金属离子、挥发性物质、氨基酸等小分子物质，以及蛋白质、细胞、组织、病毒等生物大分子的检测。本研究以“化学鼻”技术为基础，结合磁性纳米颗粒，建立了2种快速、灵敏的水产病原微生物检测方法以及应用，具体内容如下：.1.磁性-荧光蛋白“化学鼻”诊断病原微生物：利用季铵盐化的磁性纳米颗粒与三种荧光蛋白（蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白）结合加入不同种类、不同浓度的病原微生物后，由于结合作用力的差异，使得三种荧光蛋白与磁性纳米颗粒发生不同程度的分离，荧光蛋白的荧光也会得到不同程度的恢复，以线性判别分析法（LDA）为数据分析手段，对病原微生物进行诊断。本方法在30分钟内测量5×106 cfu·mL−1微生物的准确率高达89.7% 。.2.多通道磁性-荧光蛋白“化学鼻”筛选抗生素：选取以革兰式阳性菌为代表的金黄葡萄球菌和以革兰式阴性菌为代表的大肠埃希菌，将其与不同种类抗生素（浓度为其相应的IC50值）反应，再与多通道磁性荧光“化学鼻”传感器进行竞争结合，以荧光强度的变化为响应信号，通过线性判别分析和热图分析，对于分别作用于金黄葡萄球菌和大肠埃希菌的11种抗生素的筛选准确率高达97.6%和95.2%。.3.磁性-脲酶“化学鼻”诊断病原微生物：“化学鼻”传感器的响应强度取决于由三种季铵盐化的磁性纳米颗粒与脲酶的结合强度以及病原微生物与传感器之间的相互作用。本实验表明，当脲酶与磁性颗粒结合，会抑制其水解活性。因此，不同种类的病原微生物、不同浓度的微生物都会导致不同浓度的脲酶从磁性纳米颗粒表面解离，这导致脲酶的水解活性恢复。通过酶标仪在558nm的波长下，可以得到溶液的颜色变化（从黄色到红色），再通过线性判别分析（LDA）绘制指纹图谱，从而诊断病原微生物的种类与浓度。本方法在30分钟内测量102 cfu·mL−1微生物的准确率高达90.7% 。