新型近红外荧光母体的构建及其在细胞缺氧相关物种分析中的应用

Near-infrared (NIR) fluorescence probes are expected to be superior as molecular tools in biological imaging because light in the 650-900 nm wavelength region shows greater tissue penetration, has less overlap with the spectrum of background autofluorescence, and exhibits less phototoxicity. However, the current NIR fluophors such as cyanines have some deficienties and therefore limit their applications in biological imaging. Therefore, it is highly urgent to construct NIR fluophores with new structures. On the other hand, hypoxia, which is caused by an inadequate oxygen supply, is a feature of various diseases, including cancer, cardiopathy, ischemia, and vascular diseases. Therefore, hypoxia-specific molecular probes would be useful as diagnostic agents. With an aim to develop new NIR fluophores and the hypoxia-specific fluorescent probes thereafter, the present proposal will focus on the rational design and synthesis of NIR fluophores with new structures, and then make new NIR fluorescent probes by introducing the target-specific reaction group appropriately. The application of NIR probes in biological imaging will be accomplished by the target-specific response of fluorescence signals arising from the reaction between the target and its specific reaction groups. We hope the present project will provide valuable guidance and experimental basis for developing new NIR fluophores.

近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长处于约650-900 nm的范围，该波长范围的光具有很好的组织穿透性、并且在避免背景荧光的干扰、减少对活体的光损伤等方面具有突出的优越性；所以，近红外小分子荧光探针更适合作为分子工具用于生物成像方面的研究。然而，现有的近红外荧光染料因为在性能方面有一定的局限性而限制了其在生物成像分析中的应用，因而迫切需要设计构建新的近红外荧光染料以更好地满足研究需要。另一方面，多种疾病，包括癌症、心脏病、缺血以及血管疾病等所共有的一个特征就是缺氧。因此，发展缺氧的特异性荧光探针对于这些疾病的诊断将非常有用。本申请将针对以上关键问题，合理设计构建具有优良性能的新型近红外荧光染料，并通过分子设计引入目标物的特异性反应基团和位点，从而制备出具有全新结构的近红外荧光探针。利用探针识别基团对目标物的特异性反应而引起荧光信号的改变，实现对目标物的高选择性分析与成像。

本项目通过合理的分子设计，以resorufin、甲酚紫等为荧光母体，分别制备了硝基还原酶、心肌黄酶以及MMP2的特异性荧光探针。首先，我们将resorufin荧光体与硝基还原酶的识别单元5-硝基呋喃或5-硝基噻吩相连，构筑了两个可用于酪氨酸酶活性分析的长波长荧光发探针;它们具有水溶性好、反应条件温和等优点。探针在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中与硝基还原酶发生快速的反应，溶液颜色由无色变为紫红色，且溶液荧光增大100倍以上。因此，这些探针与硝基还原酶的反应具有快速、灵敏且高选择性的特点。利用这两种探针，我们分别实现了肿瘤细胞缺氧的成像研究和大肠杆菌培养液中硝基还原酶的检测。此外，基于间苯二胺聚合物的荧光淬灭性质，并且借助酶对其底物肽的特异性切割作用，我们将荧光染料FITC标记的肽段与间苯二胺聚合物组装，制备了可用于基质金属蛋白酶（MMP2）检测的间苯二胺聚合物-肽复合物荧光探针。利用该方法对人血清中的MMP2做了测定，结果表明结直肠癌患者血清中的MMP2水平是正常人的两倍。此外，我们还以甲酚紫为荧光母体，通过将结构中的氨基氧化为硝基，制备了一种新的硝基还原酶荧光探针；利用该探针我们实现了硝基还原酶和缺氧的细胞成像以及硝基还原酶在斑马鱼中的分布研究。最后，我们还以resorufin为荧光母体，以苯醌为识别基团，设计合成了一种可用于心肌黄酶检测的off-on型长波长荧光探针，并借助于酶联免疫反应将其用于人尿中葡萄糖的检测。