铜转运蛋白1和铜离子转运参与肾间质纤维化的作用及其机制研究

Copper is a necessary microelement for human. Excessive Copper ion was associated with hepatic fibrosis and pulmonary fibrosis. There is little report about their toxic effort on renal fibrosis. Our group found that:1) Copper concentration was obviously increased in UUO rat models.The use of copper chelating agent TM can alleviate renal fibrosis. 2) In rat renal fibroblasts,TGF-β1 increased significantly the expression of copper transporter 1(CTR1) and intracellular copper concentration. 3) In rat renal fibroblasts,TGF-β1 increased significantly lysine oxidase (LOXs) activity promoting extracellular matrix (ECM) cross-linking. LOXs are the key enzymes to promote fiber cross-linking, which are active in the cells after binding to copper, and then transferred to the extracellular. So, we put forward the hypothesis that the possible mechanism of copper involvement in renal interstitial fibrosis is " CTR1 was activated under pathological conditions , copper was transferred to the cells, activating LOXs, leading to excessive cross-linking of ECM and aggravated renal interstitial fibrosis." CTR1 was the key protein for the transfer of copper into the cell, and the binding of LOXs with copper was the key step in promoting fiber cross-linking. In this study, we will use the renal conditional CTR1 gene knockout mice and clinical samples to further study the molecular mechanism of CTR1 and copper in renal interstitial fibrosis.

铜是人体必需微量元素，铜离子蓄积与肝纤维化、肺纤维化相关，与肾脏纤维化尚无报道。我们课题组研究发现：1）UUO大鼠肾组织铜浓度增多，使用铜螯合剂能改善UUO肾脏纤维化；2）TGF-β1刺激大鼠成纤维细胞，可导致铜转运蛋白1（CTR1）表达升高，细胞内铜浓度增加；3）TGF-β1导致赖氨酸氧化酶(LOXs) 活性明显增加，细胞外基质（ECM）交联增加。LOXs是促进细胞外基质交联的关键酶，它在细胞内与铜结合后被激活，再转移至细胞外发挥促基质交联作用。因此，我们提出：“细胞内铜可能参与肾间质纤维化，其机制可能是：病理情况下，CTR1被激活，铜向细胞内转运增多，使LOXs过度活化，导致ECM过度交联及肾间质纤维化”。其中CTR1是将铜转入细胞内的关键蛋白，活化的LOXs是促进基质纤维交联的关键酶。本课题将利用肾脏条件性CTR1基因敲除鼠及临床样本，进一步研究CTR1及铜参与肾间质纤维化的分子机制

研究背景：. 肾间质纤维化是慢性肾脏病进展至终末期肾衰竭的共同病理改变， 肾间质纤维化分子机制十分复杂，涉及多种细胞和信号通路，缺乏特异 性治疗靶点。铜是人体必需微量元素，铜离子蓄积与肝纤维化、肺纤维化相关，与肾脏纤维化尚无报道。我们课题组前期研究发现肾间质纤维化大鼠（UUO模型）肾组织铜浓度增多，使用铜螯合剂能改善肾脏纤维化；TGF-β1刺激大鼠成纤维细胞，可导致铜转运蛋白1（CTR1）表达升高，细胞内铜浓度增加；TGF-β1导致赖氨酸氧化酶(LOXs) 活性明显增加，细胞外基质（ECM）交联增加。因此需进一步深入研究铜转运蛋白1通过调节铜离子细胞内转运促进肾间质纤维化的分子机制。.主要研究内容：.（1）TGF-β1-Smad2/3 调控 CTR1 表达的机制研究；（2）CTR1 增加铜离子细胞内流参与肾间质纤维化；（3）CTR1 导致 LOXs 过度激活参与肾间质纤维化；（4）CTR1-铜促进肾间质纤维化的临床验证。.重要结果：.1、在UUO动物模型及单侧肾缺血再灌注联合一侧肾切除动物模型中，肾间质纤维化组织可检测到铜离子水平增加及铜转运蛋白1水平升高。在大鼠成纤维细胞系中，用TGF-β1刺激细胞，同样可观察到铜离子水平和CTR1水平升高。.2、在细胞实验中可观察到TGF-β1通过上调smad3与CTR1转录启动子结合来刺激CTR1表达升高。.3、在肾间质纤维化组织中可检测到LOX活性增加。.4、在动物实验中，给予铜离子螯合剂可降低LOX活性并改善肾间质纤维化。.5、在人体肾穿刺活检标本中进行免疫组化染色，可观察到肾间质纤维化水平与CTR1和LOX水平呈正相关。.关键数据及其科学意义：.在本课题中，我们研究发现在肾间质纤维化动物模型中，肾组织铜离子水平较对照组明显升高，进一步研究发现，铜离子水平升高的原因为TGF-β1刺激smad3与CTR1转录启动子结合，促进CTR1转录，从而促进铜离子转运，铜离子转运增加刺激LOX活性增加，进入肾间质，促进细胞外基质交联。本课题的研究丰富了肾间质纤维化的机制假说，为慢性肾脏病，肾间质纤维的治疗增加了潜在的干预靶点。