α-突触核蛋白在METH神经毒性损伤机制中的功能研究

在前项国家自然基金项目中，蛋白组学研究发现α-突触核蛋白（α-SN）在甲基苯丙胺用药大鼠相关脑区均表达上升。为了深入研究α-SN在METH神经毒性损伤机制中的关键作用，拟在细胞和动物水平上，利用RNAi技术沉默其转录表达，在此基础上建立METH用药模型，通过⑴HPLC检测DA及其代谢产物DOPAC的含量，利用western blot和RT-PCR技术检测酪氨酸羟化酶（TH）含量，⑵酶化学方法检测ROS、nNOS、NO和ONOO-等含量或活性，⑶western blot技术检测α-SN硝基化，⑷流式细胞仪和激光共聚焦等技术检测Ca2+内流、线粒体跨膜电位、通透性和细胞凋亡；⑸观察动物行为学及相关脑区病理改变，研究 α-SN在METH所致的多巴胺耗竭、氧化应激、膜通透性改变、线粒体损伤和神经元凋亡等损伤机制中的重要功能，寻找毒性损伤的关键靶点，为发展戒毒解毒药物和法医病理学诊断开辟新的道路。

本课题主要研究α-突触核蛋白在METH所致的神经损伤中的作用机理。利用多巴胺能SH-SY5Y细胞系建立METH中毒细胞模型，在细胞活力下降和诱导细胞凋亡的同时，α-突触核蛋白的表达量急剧增高。利用RNA干扰技术沉默细胞内α-突触核蛋白的表达后，发现可以改善METH中毒所造成的多巴胺耗竭，提高TH、DAT和VMAT-2的表达水平，降低ROS活性、NOS活性和NO含量，缓解线粒体功能障碍，降低细胞的凋亡率，提高细胞生存率。上述结果在细胞水平上证实了α-突触核蛋白在METH中毒所引起的多巴胺能系统损伤、氧化应激系统失衡和线粒体功能障碍中发挥了重要的作用。建立α-突触核蛋白RNAi的METH中毒大鼠模型，发现α-突触核蛋白被沉默后，动物异常行为减少，相关指标表明α-突触核蛋白RNAi后对氧化应激的损伤和神经元凋亡有抑制作用，这说明体内外实验结果是一致的。应用iTRAQ技术筛选METH作用及RNA干扰α-SN后的大鼠模型，在纹状体区发现有65种差异蛋白，检索蛋白功能也进一步反映了α-SN的神经毒性的上述损伤机理。总之，我们的研究结果证实了α-突触核蛋白在METH中毒机制中发挥了关键性的作用，为法医病理诊断和为发展新型解毒药物提供新的思路，具有重大理论意义和潜在应用价值。