对虾细胞表面ATP合酶在WSSV侵染中的作用机制

ATP合酶是生物进行能量代谢的关键酶，目前研究表明ATP合酶不仅分布在线粒体内膜上，也会异位分布在细胞膜上，其可溶性的F1部分暴露在细胞表面，作为细胞膜的受体。有学者证实在小鼠和人等物种的细胞表面ATP合酶定位在质膜的脂筏(lipid raft)上，而脂筏在流感病毒、HIV、SARS、登革热病毒等的侵入、装配过程中都发挥了重要的作用。本实验室前期对白斑综合征病毒(WSSV)与宿主的相互作用研究中，鉴定得到F1-ATP合酶β亚基参与了WSSV感染，并且分布在对虾鳃组织的质膜和血细胞的表面，它与参与细胞分化的Astakine (螯虾因子)也具有特异性相互作用。本项目围绕WSSV可能依赖ATP合酶定位到宿主细胞表面，并通过脂筏介导的内吞或融合的方式进入宿主细胞的过程，在细胞、蛋白水平研究细胞表面ATP合酶在WSSV侵染宿主细胞过程中的作用，为阐明WSSV感染的分子机制提供理论依据。

我们的前期研究发现对虾F1-ATP合酶β亚基（ATPsyn β，BP53）可能是白斑综合征病毒（WSSV）的受体蛋白。为进一步解析BP53与WSSV感染相关的生物功能，并为阐明WSSV感染的分子机制提供更丰富的理论依据。本项目围绕WSSV、ATP合酶、脂筏，在细胞、蛋白水平研究细胞表面ATP合酶在WSSV侵染宿主的作用展开研究。1、WSSV可能以内吞途径侵染宿主细胞。脂筏结构富含胆固醇和鞘脂，参与多种病毒的侵入、组装和出芽。通过免疫杂交和免疫共定位研究，我们发现BP53存在于脂筏结构域中并与其中的两个蛋白存在相互作用。另外，通过免疫荧光显微镜观察和流式细胞仪分析，发现WSSV的粘附蛋白VP37和VP28可以介导宿主细胞的内吞，而这两种蛋白又是BP53的互作蛋白。结合VP37/VP28、BP53和脂筏之间存在的互作关系，推测WSSV通过脂筏介导的内吞途径进入宿主细胞。2、WSSV结合和感染需要消耗宿主ATP能量。在很多囊膜病毒的结合、成熟、组装和出芽阶段都需要ATP能量。在本项目研究中首先通过生物发光检测实验，在贴壁的对虾血细胞上清中检测到ATP合成，并发现WSSV的体外结合和自然感染都会显著降低血细胞体外的ATP产量。另外，通过RNAi干扰掉对虾体内bp53基因，抑制其转录表达，可以引起100%的对虾死亡。这些研究数据进一步证实bp53在维持对虾正常生命活动中的重要地位，同时说明WSSV感染宿主时，可能通过与ATPsyn β相互作用扰乱宿主的能量代谢机制。3、螯虾因子（astakine，AST）和WSSV共用BP53为受体，AST可能参与宿主抵御WSSV的感染。通过结合实验和免疫共沉淀我们发现AST和VP37竞争与BP53的结合，而两者之间不能相互结合。通过体内中和实验证实人工注射重组AST蛋白可以降低宿主对虾对WSSV的易感性，延长WSSV感染后对虾的存活时间。用RNAi消减AST基因的转录水平则会显著增强WSSV的感染强度，缩短对虾存活时间。这些研究结果提示AST可能参与宿主的抗病毒免疫活动。.结论：基于上述研究结果，可以推论WSSV以对虾细胞表面的ATP合酶β亚基为受体，以脂筏介导的内吞作用入侵宿主细胞，在其结合和增殖期间大量消耗宿主ATP能量，并利用其粘附蛋白VP37竞争AST的受体ATP合酶β亚基，进而干扰宿主细胞分化，扰乱机体的正常生命活动。