Aβ3-10重复片段质粒免疫对APPswe/PSEN1双转基因鼠β淀粉样蛋白产生通路的影响及其机制的研究

In the past, only the clearance of Aβ deposition and its mechanisms were concerned during Aβ vaccine researches, and Aβ deposition formation pathway was ignored. There are two ways of APP metabolism: α and β pathway. BACE1 and γ-secretase are important proteases to control Aβ formation during β pathway. Our study has demonstrated Aβ3-10 repeat fragment plasmid improve memory and cognitive function impairment of Tg-APPswe/PSEN1dE9 mice by reducing Aβ deposition and inflammatory response. But whether the reduction of Aβ deposition and inflammatory response by the plasmid will affect Aβ generation pathway? Whether it will affect the expression and activity of BACE1/APP/γ-secretase? What is the mechanism? Therefore, Aβ3-10 repeat fragment plasmid will be applied to immune 3,12-month-old Tg-APPswe/PSEN1dE9 mice, and blank and normal C57BL/6J control groups will be set. The changes of BACE1/APP/γ-secretase protein and mRNA level, BACE1 distribution and its relationship with Aβ deposition, BACE1 expression in neuron and activated astrocyte, and NF-κB level will be detected during plasmid immunity before and after Aβ deposition formation in the brain of transgenic mice. Explore the effect and mechanism of Aβ deposition formation pathway during Aβ3-10 repeat fragment plasmid immunity.

Aβ疫苗研究以往只关注其对Aβ沉积清除及机制，忽略了对Aβ沉积产生通路的影响。APP通过α和β两个途径代谢，BACE1及γ分泌酶是控制β途径Aβ形成重要的蛋白酶。我们的研究Aβ3-10重复片段质粒改善APPswe/PSEN1双转基因鼠记忆和认知功能的损害是通过降低Aβ沉积和炎症反应，那么质粒对Aβ沉积和炎症反应的下调是否会影响Aβ产生通路呢？是否会影响BACE1/APP/γ分泌酶的表达及活性呢？机制是什么？所以拟应用Aβ3-10重复片段质粒免疫3、12月龄的APPswe/PSEN1双转基因鼠，设置空白及正常C57BL/6J对照组，检测质粒免疫中转基因鼠脑内Aβ沉积形成前及之后BACE1/APP/γ分泌酶蛋白及mRNA水平、BACE1分布及其与Aβ沉积的关系、神经元及被激活星形胶质细胞中BACE1表达水平、NF-κB水平的变化。探讨Aβ3-10重复片段质粒免疫对Aβ沉积产生通路影响及机制。

阿尔茨海默（AD）是一种神经变性疾病，以记忆力和认知功能损害为特点，最核心病理特点为β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑和细胞内过度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结。McGeer等人在 1994年首先提出的“免疫和炎症”学说，提出AD的发病与炎症相关。已经有研究显示通过Aβ3-10免疫治疗可改善Tg-APPswe/PSEN1 dE9 双转基因鼠的记忆和认知功能的损害。本研究主要通过质粒pcDNA3.1-（Aβ3-10）10-CPG构建、表达、鉴定，检测BACE1/APP/γ分泌酶(PS1) / NF-κB蛋白表达水平，检测BACE1/APP 的mRNA表达水平，检测BACE1、Aβ沉积在脑内分布情况，观察各组鼠的行为学改变来进一步了解Aβ3-10疫苗治疗对Aβ沉积产生通路的影响。实验结果显示 APP mRNA 和BACE1 mRNA的表达在3月龄组免疫6次时Aβ3-10组明显高于对照组有统计学差异（p<0.05）。在western blotting中通过检测相对灰度值统计得出BACE1，APP蛋白的表达在Aβ3-10组中均高于对照组，但没有明显统计学差异，GFAP的表达在两组之间也没有明显差异，而NF-κB，PS1的表达在免疫2,4,6次后Aβ3-10组均高于对照组，且有统计学差异（p<0.05）。在12月龄组免疫6次后APP，BACE1 mRNA的表达Aβ3-10组低于对照组且有统计学差异（p<0.05），western blotting 中BACE1，APP，NF-κB的蛋白表达在免疫6次后Aβ3-10组均低于对照组（p<0.05），GFAP的蛋白表达在免疫2,4,6次后其Aβ3-10组均低于对照组且有统计学差异（p<0.05），PS1的蛋白表达在免疫4次时Aβ3-10组高于对照组且有统计学差异（p<0.05）。以上实验我们推测免疫治疗可能对幼年鼠的作用不是很明显，其原因可能是转基因小鼠产生淀粉样蛋白通常是在6月龄左右，而此时我们的幼年组小鼠刚刚接受第4次免疫，可能不能很好的起到免疫和预防效果。对于12月龄组通过免疫6次后，我们发现会有一定的作用。通过免疫组化得出12月龄鼠在免疫6次后海马和皮质区Aβ，BACE1的表达均是Aβ3-10组低于对照组，且有统计学差异（p<0.05）。在水迷宫实验中，我们也可得出通过质粒免疫的小鼠其学习及空间记忆能力均有所改善。