海冰细菌Colwellia sp.硫氧还蛋白(Trx)的基因克隆与功能分析

硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）是一类小分子多功能蛋白，一般都具有高度保守的活性位点(WC[G/P]PC)，它通过还原靶蛋白中的二硫键参与酶活性调节、转录因子、各种胁迫应答和调控、信号传导等，在生物抗逆系统中起着重要的作用。前期研究结果表明，Trx可能在南极微生物适应极端环境中发挥重要作用。为此，本研究拟以南极海冰细菌Colwellia sp.为材料，在获得Trx全长基因序列的基础上，首先通过生物信息学方法分析Trx基因结构，推测Trx关键的活性位点，并预测其功能，进而采用定点突变、转基因、RT-PCR和Western 杂交等手段对其生物活性和功能进行系统研究，以期从全新的角度和更深的层次认识海冰细菌Trx的功能、活性位点与功能之间的关系，以及Trx在微生物低温适应性中的作用，进一步完善南极微生物低温适应性的分子机制，同时也为抗寒冷和抗冰冻生物遗传育种提供新的基因。

本研究从海冰细菌中克隆出硫氧还蛋白（Trx）全长基因（PsTrx），利用生物信息学方法对PsTrx基因进行了分析和预测。该基因大小为327 bp，编码108个氨基酸，推测其关键活性位点为Cys33和Cys36，含4个α-螺旋和5个β-折叠。利用定点突变技术进一步验证Trx蛋白关键活性位点。将PsTrx基因转入E.coli BL21中，实现了异源表达。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化，通过SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行了检测和验证。在纯化基础上，对重组蛋白的生化活性进行了系统研究。利用FQ-PCR技术分析Trx基因表达特征，其中9%盐度下的Trx表达量是对照组的2.5倍；结合转基因菌株表征分析，探讨了Trx基因在海冰细菌耐盐机制中所起的作用。同时对与Trx相关的TrxR和GST基因进行了克隆、表达以及活性研究。本研究进一步完善海冰微生物极端环境适应机制，为抗逆生物遗传育种提供了新基因。在项目资助下正式发表论文8篇，其中SCI收录论文6篇，培养研究生5名。