砧用南瓜盐胁迫响应基因表达谱分析及重要耐盐基因鉴定

项目组前期研究发现，采用耐盐南瓜嫁接可显著提高黄瓜的耐盐性，嫁接植株的耐盐能力主要取决于南瓜砧木。本项目以筛选出的盐敏感和耐盐砧用南瓜为材料，构建盐胁迫下的4种SSH文库；利用cDNA芯片杂交筛选盐胁迫响应差异表达的EST，对差异表达克隆测序，进行生物信息学分析，筛选耐盐候选相关基因，通过定量RT- PCR验证其盐胁迫响应特征；采用RNA原位杂交研究耐盐基因在南瓜砧木根系不同组织中的表达，使用X-射线微区分析技术检测Na+的分布；利用RACE技术克隆耐盐重要候选基因全长cDNA；采用酵母互补实验进行功能验证；将GFP和GUS作为报告基因分别研究亚细胞定位和组织表达；构建重要耐盐候选基因的超表达和RNAi表达载体，转化南瓜获得转基因植株并对其进行耐盐性鉴定。本项目完成后可获得砧用南瓜耐盐重要基因，解析砧用南瓜耐盐分子机制，为进一步揭示耐盐砧木嫁接提高黄瓜耐盐的分子机制奠定基础。

项目组前期研究发现，采用耐盐南瓜嫁接可显著提高黄瓜的耐盐性，嫁接植株的耐盐能力主要取决于南瓜砧木。本项目以对Na+积累具有差异的南瓜品系N12和N15为材料，分析了NaCl胁迫下两个南瓜材料不同部位对Na+积累的差异；采用高通量测序技术对盐胁迫4小时的材料进行转录组、表达谱和小RNA测序，通过基因表达分析验证筛选候选耐盐基因，并对其进行功能验证。结果发现两个南瓜材料在Na+积累模式上具有较大差异，N12在地上部积累Na+，而N15在地下部积累Na+。采用非损伤微测技术（NMT）分析了两个南瓜材料不同部位Na+的净流速，表明N12通过将Na+限制在叶脉中，减少其向叶肉的运输来降低对叶肉细胞的伤害，基因表达分析表明这一过程主要由叶脉中HKT1的大量表达来完成。表达谱测序结果显示钙调蛋白、多种激素和转录因子以及热激蛋白等参与了南瓜对NaCl胁迫的早期应答。小RNA测序发现部分差异表达的miRNAs的靶基因为盐胁迫响应基因。对叶片ABA含量和光合参数的分析表明NaCl胁迫后N12叶片中ABA含量快速上升，气孔迅速关闭，从而减少了对光合组织的损伤，能更好适应NaCl胁迫。qRT-PCR的分析表明耐盐候选基因CmNAC1不仅受到NaCl胁迫诱导，而且响应干旱和低温胁迫，受ABA、H2O2诱导，GA对其有抑制作用。拟南芥超表达CmNAC1后NaCl胁迫耐受性显著提高，其ABA合成关键基因NCED3、ROS标记基因ZAT10、ZAT12相比野生型有更高的表达量。综述所述，本研究从生理、组学、基因表达、分子等各个方面、不同层次综合解释了南瓜适应盐胁迫的机制，为进一步深入解析南瓜耐盐的分子机制奠定了基础。