氧化应激相关分化因子与软骨深层坏死的分子机制研究

The characteristic pathological change of Kashin-Beck disease(KBD) is the occurrance of chondronecrosis and disturbance of endochondral ossification in hyaline cartilage including articular cartilage and growth plates.Our previous study showed oxidant damage in cartilage of KBD and a rat KBD model by employing T-2 toxin treatment under selenium deficient conditions. Thus, our hypothesis is that oxidative stress-dependent induction of abnormal differentiation regulation may involved in chondronecrosis in the deep zone of cartilages of KBD. Three specific aims are proposed to address the hypothesis using ATDC5 chondrocyte culture and engeering cartilage models. Specific Aim 1 is designed to screen out the abnormal differentiation factors involved in hypertrophic cell death induced by SIN-1,a ONOO- donor，using the Mouse Osteogenesis RT2 Profiler? PCR Array. Specific Aim 2 will identify whether these abnormal differentiation factors expression changes with onset and progression in catilage and serum due to children KBD and adult KBD. In Specific Aim 3，we will determine the effects of abnormal differentiation factors over-expression or down-expression on chondronecrosis in the deep zone of cartilages, we will examine the mechanisms by which these abnormal differentiation factors are activated and regulates expression of a critical cartilage-degrading enzyme, matrix metalloproteinase-13, and a critical cartilage hypertrophic zone maker, collagen X using Lusifearase assay, and make use of conditional Knock-in or transgenic chondrocytes of these abnormal differentiation factors to establish engeering cartilages. These in vivo and in vitro approaches will provide rationale evidence for elicidating the molecular mechanisms of chondronecrosis in KBD and developing novel targeted therapeutic intervention against KBD progression.

软骨深层坏死和软骨内化骨障碍是大骨节病（KBD）的病理特征，分子机制不明。我们前期研究结果发现氧化损伤与KBD软骨坏死关系密切，结合文献，提出氧化应激诱导的肥大层软骨细胞分化调节异常可能是KBD软骨深层坏死和分化障碍的重要机制。本项目以氧化应激为切入点，以肥大软骨细胞和体外再建软骨组织为研究对象，通过：①高通量RT-PCR液态芯片等技术筛选差异表达的氧化应激损伤相关分化因子；②采用Real-time PCR、免疫组化和Western Blot等技术，检测所筛选氧化应激相关分化因子在KBD软骨和血液中的表达，探讨氧化应激相关分化调节和KBD的关系；③采用荧光素酶测定、基因敲除/敲入等功能学研究技术，明确筛选出的分化因子致肥大软骨细胞死亡和再建软骨组织深层坏死的分子机制。通过系统研究氧化应激致软骨细胞异常分化调节对软骨深层坏死的影响，揭示KBD的发病机制，为KBD临床治疗提供新的治疗策略。

我们的前期研究发现，大骨节病（Kashin-Beck disease，KBD）的软骨坏死与氧化应激有关， KBD的发生发展是以自由基引起的氧化应激损伤作用为核心的病理过程。KBD软骨坏死以侵犯骺生长板和关节软骨的深层软骨细胞为主，KBD的发生涉及软骨内化骨和分化障碍。本项目以氧化应激所诱发的分化调节障碍为切入点，直接以KBD靶细胞-成熟中肥大软骨细胞为研究对象，研究KBD儿童软骨内化骨障碍，揭示病理性软骨内化骨障碍以及软骨坏死的发病机制。本研究发现自由基供体SIN-1可以引起软骨肥大细胞坏死，和大骨节病关节和骺板深层软骨细胞死亡形式一致。利用液态芯片Mouse Osteogenesis RT² Profiler™ PCR Array方法，筛选出SIN-1下调肥大软骨细胞终末分化相关的34个基因和上调6个基因。用KBD和低硒条件下T-2毒素中毒大鼠模型的对比研究进行验证，结合功能研究技术发现，KBD可疑病因低硒和T-2毒素动物可以上调软骨分化负性调节信号分子FGF8及其配体FGFR-3通路，下调软骨分化正性调节信号分子TGF-β1-Smad通路，共同作用于下游靶分子MMP-10，影响软骨基质塑性，抑制深层软骨细胞的成熟和肥大，并导致深层软骨细胞的死亡。同时，低硒条件下T-2毒素可以下调整合素Integrin αv和Integrin α2水平，阻断细胞与细胞外基质的信息交流，加重了KBD的分化障碍和软骨细胞死亡。本项目执行中，不仅用KBD儿童软骨样本进行验证，而且结合前期完成的低硒条件下T-2毒素中毒大鼠模型，将可疑病因、分化障碍和KBD三者结合起来展开工作，最后用功能学方法进行了分化调节靶基因MMP-10对软骨组织深层坏死的分子机制研究，系统完成了氧化应激致软骨细胞异常分化调节对软骨深层坏死的影响。已经发表3篇SCI论文，7篇在国内外有影响的杂志上“中华地方病学杂志”，仍会有5篇SCI论文将连续发表在国外有影响的SCI杂志上。在第九次全国地方病学术会议上，将本项目研究结果进行了一次综述性的大会报告，获得良好评价。在国际骨关节病相关会议上进行了2次大会报告。根据本项目为基础，申请一项国家自然科学基金面上项目（项目编号：81573102）。