人β防御素2基因治疗泌尿系感染的实验研究

泌尿系感染是常见细菌感染性疾病，大量耐药菌的出现使其临床治疗更加棘手，寻找新型的治疗措施迫在眉睫。防御素由于其广谱、高效、不易产生耐药性的杀菌机制，近年来倍受关注。我们已成功构建出人β-防御素-2（hBD-2）基因真核表达载体pCAGG-hBD-2，为此，本课题拟通过转基因技术将该载体体外转染人膀胱上皮细胞及进行大鼠膀胱原位转染后，采用ELISA、免疫荧光、RT-PCR及Western blotting 等方法检测转基因hBD-2 在体内、外转染细胞中的表达,探讨应用该载体获得重组hBD-2在泌尿道表达的可行性；同时以泌尿系感染大鼠为动物模型，通过检测细菌清除率、组织病理、炎症因子和生存分析等指标，对转基因hBD-2在泌尿系感染中的保护作用进行研究，以期为难治性泌尿系感染防治提供新手段；为解决细菌耐药等问题提供新思路；为hBD-2治疗感染的新特药开发提供理论依据。

泌尿系感染是常见细菌感染性疾病，大量耐药菌的出现使其临床治疗更加棘手。防御素由于其广谱、高效、不易产生耐药性的杀菌机制，近年来倍受关注。本课题以人β-防御素-2(hBD-2)为研究对象，通过基因工程技术构建携带hBD-2基因的重组真核表达载体pCAGG-hBD-2。采用脂质体法转染人膀胱上皮细胞株T24及大鼠膀胱内原位转染后，ELISA法检测细胞上清及大鼠尿液中重组hBD-2的表达；RT-PCR及Western blotting检测细胞及大鼠膀胱中hBD-2基因在mRNA及蛋白质水平的表达。同时以泌尿系感染大鼠为动物模型，进行重组hBD2对泌尿系感染的保护作用研究，包括细菌清除率、组织病理变化、炎症评分。结果发现： 经RT-PCR及Western blotting检测证实，pCAGG-hBD-2转染T24细胞和大鼠膀胱后均可表达重组hBD-2；ELISA检测证实转染细胞上清及大鼠尿液中重组hBD-2的浓度分别为36.5 ±3.2 ng/106cells和4.77±1.4ng/mL；通过膀胱灌注hBD-2基因载体的脂质体复合物，可成功转染大鼠膀胱粘膜。同时以泌尿系感染大鼠为动物模型，成功获得了原位转基因hBD-2在泌尿系感染中具有显著的预防及治疗作用，其治疗作用可能是直接的杀菌与免疫调节机制双重作用的结果。因此，hBD-2基因治疗可能成为一种有发展前景的预防和治疗难治性泌尿系感染的策略。同时由于hBD-2具有可诱导表达的特性，研究表明hBD-2表达水平升高与肾盂肾炎的发生发展密切相关。我们进一步观察了LPS 及促炎症因子IL-1β诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）hBD-2的表达及抗菌活性，并对其诱导表达的信号传导通路进行了初步探讨。结果发现：HK-2细胞有微量hBD-2 mRNA表达，一定剂量的LPS及前炎症细胞因子可诱导人肾小管上皮细胞hBD-2表达，表达呈剂量依赖性；应用TLR4及NF-κB阻断剂预处理肾小管上皮细胞1h 后，给予1 ug/ml的LPS 作用12h后，检测hBD-2表达量下降，表明其表达与TLR4/NF-κB信号传导通路有关，是肾小管最初病原微生物防御反应，将为泌尿系感染防治提供新靶点。