秋茄水通道蛋白基因KoAQP响应低温胁迫的分子生态学机制研究

Mangrove ecosystem is the key ecological area in tropical and subtropical coastal zone. Extreme low temperature has caused seriously threat to the survival and development of mangroves. However, the molecular ecological mechanisms of mangrove plants in response to low temperature are still poorly understood. The partial sequence of the Kandelia obovata aquaporin gene (KoAQP) had been screened from a cDNA library of K. obovata by the applicant. Preliminary research has shown the KoAQP increased significantly responding to low temperature in K. obovata, which indicated that KoAQP may play an important role in responding to low temperature in K. obovata. Based on previous studies, multidisciplinary cross technologies, such as molecular biology, bioinformatics and genetic engineering will be used in this project. The full-length of KoAQP will be cloned by RACE skill and be predicted by bioinformatics analysis. The qRT-PCR technology will be used to analyse the expressions of KoAQP responding to low temperature in K. obovata. Heterogenous expression method will be adopted for KoAQP to analyze subcellular localization, water transport activity and cold-resistance function. The molecular ecological mechanism of the KoAQP in response to low temperature stress will be revealed further.This project is not only a supplement for the understanding of mangrove plants responding to low temperature, but also provides theoretical basis and technical support for the protection, recovery and northern introduction of mangroves.

红树林是热带、亚热带海岸带的生态关键区，其生存和发展正遭受着极端低温天气的严重威胁。然而红树植物响应低温胁迫的分子生态学机制尚不清楚。申请人前期已得到耐寒性红树植物秋茄的水通道蛋白基因KoAQP的部分序列，经初步研究发现其在低温胁迫下显著高表达，提示其可能在红树植物响应低温胁迫过程中发挥重要作用。为此，本项目拟在前期基础上，利用分子生物学、生物信息学和基因工程等多学科交叉技术，对秋茄KoAQP基因的全长进行克隆及生物信息学分析；通过实时定量技术探讨其在低温胁迫下的时空表达调控模式；并利用基因异源表达技术对其亚细胞定位、水分运输功能及抗寒功能进行分析验证，以进一步深入揭示KoAQP基因在秋茄低温胁迫响应过程中的分子生态学机制。本项目不仅是对红树植物低温胁迫响应分子机制的补充，同时也为红树林的保护、恢复及北移引种提供理论依据和技术支持。

红树林的生存和发展正遭受着极端低温天气的严重威胁，而红树植物响应低温胁迫的分子生态学机制研究很少。为此，本项目在前期基础上，利用分子生物学、生物信息学和基因工程等多学科交叉技术，开展秋茄水通道蛋白基因KoAQP响应低温胁迫的分子生态学机制研究。本项目克隆获得了秋茄KoAQP基因全长序列，分析表明KoAQP基因的开放阅读框包含852个核苷酸，编码283个氨基酸, 分子量为30.41 kDa，等电点为 6.05。KoAQP蛋白包含了大多数水通道蛋白所具有的6个跨膜结构区域和2个NPA基序。三维模型结构显示KoAQP蛋白由同源四聚体组成，每一个单聚体包含了10个α螺旋结构和2个β折叠。此外，KoAQP的氨基酸序列与来源于橡胶树（Hevea brasiliensis）的水通道蛋白PIP2-2同源性最高（91.26%），多序列比对与系统进化树结果也进一步证实了KoAQP蛋白属于水通道蛋白PIP2亚类分支上。亚细胞定位结果表明KoAQP蛋白定位于细胞质膜上。实时定量表达分析表明，KoAQP基因主要在秋茄的叶中表达，其次是根和茎，且随着低温胁迫时间延长，KoAQP基因在根、茎、叶中均呈现先升高后降低的趋势。这表明KoAQP可能在秋茄抵抗低温胁迫的早期起了一定调节作用，但是随着时间的延长，秋茄所受低温伤害程度加剧，KoAQP的调节作用减弱，胁迫时间的延长最终难以使秋茄免受低温侵害。在原核生物中过表达KoAQP基因，发现KoAQP基因能增强大肠杆菌的耐寒能力。在爪蟾卵母细胞中过表达KoAQP基因，结果证实了KoAQP能增强卵母细胞的水分运输能力，这表明KoAQP可能通过调节水分缓解秋茄低温伤害，从而增强秋茄的抗寒能力。本项目深入揭示了KoAQP基因在秋茄响应低温胁迫过程中的分子生态学机制，不仅是对红树植物响应低温胁迫分子机制的补充，同时也为红树林的保护、恢复及北移引种提供理论依据和技术支持。