基于共振拉曼分子探针的细胞器选择性成像与拉曼免疫标记应用研究

Raman spectroscopy is uniquely capable of comprehensive characterization of the intracellular biomolecular environment, by analyzing Raman scattering from all cellular molecules. Development of molecular probes for Raman spectroscopy enabling to monitor location of specific organelles or biomolecular complexes would greatly advance the capabilities of traditional Raman imaging in molecular sensing and quantitative characterization of the cellular structure. Here we design a family of Azobenzene-based novel Raman Probes, capable of providing unprecedentedly high detection sensitivity with (through) Resonance Raman enhancement. Firstly, We design and optimize Raman reporter structure to get good signal-noise ratio and Raman intensity, then modify the structure for labelling and rapid Raman imaging membranes, mitochondria. Secondly, we conjugate the Raman reporter to the detection antibody and investigate Raman based cellular immuno-detection labelling and imaging of DNA replication sites in cells undergoing the S-phase of the cell cycle. The very first Raman reporter that we prepared shows good signal-to-noise ratio and the detection limit in biological environment is low up to 0.01mM. This study is academically valuable for achieving highly sensitive and rapid detection of specific biological molecules in live cells. Raman based immuno-detection would further expand the capabilities of bioimaging offering valuable information of biochemical environment in the cellular sites targeted with antibodies.

拉曼光谱技术通过分析细胞内分子的非弹性散射获取生物分子环境信息，基于拉曼的分子探针可以实现对特定细胞器或生物分子的标记和监测，促进拉曼成像在细胞内分子监测及量化中的应用。本项目拟设计基于偶氮苯基团的新型共振拉曼分子探针，实现细胞内特定组分的标记及拉曼成像。偶氮苯基团较低的荧光量子产率为探针拉曼信号获得良好的信噪比提供了前提。主要从两方面展开工作：一调整分子结构优化拉曼信号的信噪比及强度，并修改探针结构实现线粒体、细胞膜等的标记及拉曼成像；二利用该探针修饰检测抗体，并通过免疫拉曼标记实现S-期细胞DNA复制位点的成像。前期工作中使用532 nm作为激发光源对探针原型进行过初测，结果显示生物环境中该探针检测极限可达到0.01 mM。本研究对实现活体细胞内特定生物分子的高灵敏度快速检测具有重要学术意义，基于拉曼的免疫检测将扩展生物成像的能力，同时获取细胞内标记对象及其环境的重要信息。

细胞中存在成千上万的生物分子如DNA，RNA，蛋白质，糖类及脂肪等，它们调节和控制着细胞内全部的生理过程。对这些特定分子群体的选择性检测可以实现细胞内特定生理过程的实时监测。基于荧光的技术只能收集被标记的分子信息，无法得到未标记分子的分布信息。拉曼光谱技术则克服了荧光标记的局限，光谱能够给出被测样品的所有分子信息。基于拉曼光谱技术的分子探针则可以实现细胞内标记及未标记分子的监测，同时获取特定感兴趣分子及其周围环境信息，从而促进拉曼成像在细胞内分子监测及量化中的应用。但传统拉曼光谱技术检测灵敏度低，检测极限约为10mM，而细胞内大多数分子浓度较低，从而限制了拉曼技术在生物成像中的应用。基于纳米粒子表面电场增强的SERS探针被尝试用于细胞内部标记，但因为纳米粒子的尺寸远远大于细胞内分子尺寸，SERS应用于细胞内细胞器或特定生物分子的标记是极富挑战性的。共振拉曼增强技术不同于 SERS，这种方法以分析物电子吸收带光谱峰的邻近波长作为激发波长，从而提高检测灵敏度。细胞各组分的吸收光谱位于短波长区域，本项目的思想是发展吸收光谱位于可见光区的共振拉曼探针用于细胞组分的标记和成像。.偶氮苯基团具有非常低的荧光量子产率，本项目正是利用这个特点设计了基于偶氮苯基团的共振拉曼分子探针。该探针在可见光波段可以产生共振拉曼增强，且拉曼信号具有良好的信噪比；实验表明，当选定激发波长532nm时溶液中探针的检测极限可达到1µM。项目运用经典方法生成其衍生物实现了细胞内线粒体、细胞膜的标记并完成拉曼成像，并实现快速拉曼成像。共振增强效应大大提高了检测灵敏度和成像速度，运用基于点扫描的拉曼成像系统，在20分钟的扫描时间内得到高质量的拉曼成像。相比金属纳米粒子，共振拉曼探针的小尺寸使其相当容易地进入细胞内部，且具有良好的化学稳定性和生物兼容性，相信本项目提出的新方法对实现活体细胞内特定生物分子的拉曼检测具有重要意义，能够在生命科学研究中发挥独特的优势。