抗dsDNA抗体以α辅肌动蛋白4为靶抗原诱导系膜细胞表型转化的分子机制研究

抗双链DNA（dsDNA）抗体与系统性红斑狼疮的肾脏损害关系密切，它能以α辅肌动蛋白4为靶抗原与系膜细胞结合，并诱导趋向肌成纤维细胞表型转化，但具体机制不明。现已证实，骨架微结构改变是细胞表型转化的关键，而α辅肌动蛋白4能参与细胞骨架主要成分肌动蛋白的交联平衡。基于前期研究，推测抗dsDNA抗体可能改变α辅肌动蛋白4的空间构象或电荷负载，进而干扰"α辅肌动蛋白4-Ca2+结合平衡"，最终诱导系膜细胞表型转化。本课题拟通过cDNA文库表达α辅肌动蛋白4，研究胞外环境下抗dsDNA抗体对α辅肌动蛋白4的构象与电荷的影响，以及对"α辅肌动蛋白4-Ca2+平衡"的作用；同时借助免疫电镜、蛋白印迹等技术，研究胞内状态时抗dsDNA抗体调控该平衡体系，最终诱导系膜细胞表型转化的效应。本实验有望揭示抗dsDNA抗体诱导系膜细胞表型转化的部分机制，为探索治疗狼疮肾脏损害的新途径奠定基础。

抗双链DNA（dsDNA）抗体与系统性红斑狼疮的肾脏损害关系密切，它能以α辅肌动蛋白4为靶抗原与系膜细胞结合，而α辅肌动蛋白4能参与细胞骨架肌动蛋白的交联平衡。本课题首次通过体内与体外实验，研究了致病性抗dsDNA抗体诱导肾脏系膜细胞趋向肌成纤维细胞表型的作用及其分子机制。结果发现，抗dsDNA抗体可影响α辅肌动蛋白4的电荷负载和蛋白质构象，抑制α辅肌动蛋白4与Ca2+结合，导致系膜细胞肌动蛋白解离平衡发生变化，最终参与细胞表型改变。. 主要科学发现包括：1）抗dsDNA抗体诱导体内肾脏系膜细胞趋向于肌成纤维细胞表型转化。与血清抗dsDNA抗体阴性的小鼠模型（马脾铁蛋白或牛血清蛋白免疫）比较，抗体阳性小鼠（DNA抗原免疫）的肾脏呈现更多肾小球系膜区基质沉积及平滑肌肌动蛋白、III型胶原及层粘连蛋白强表达。在SLE患者中，抗dsDNA抗体滴度与IV-G型狼疮性肾炎的系膜区基质沉积呈正相关。2）抗dsDNA抗体对体外培养系膜细胞表型的影响。将源于BXSB狼疮小鼠血清的纯化抗dsDNA抗体与系膜细胞培养，可促进层粘连蛋白、纤维连接蛋白、α平滑肌肌动蛋白及转化生长因子β表达，部分结果呈剂量依赖关系。形态学观察提示肌成纤维细胞的特征。3）抗dsDNA抗体Fab片段增加α-辅肌动蛋白4的阳离子电荷负载。将制备的IgG3型抗dsDNA抗体Fab片段（等电点8.9）与α-辅肌动蛋白4结合后，后者的等电点由5.8升至7.5。4）抗dsDNA抗体与α辅肌动蛋白4发生高度特异性结合，并影响后者二级结构。表面等离子共振技术测定两者结合力KD值为98.24±7.80×10-10M。采用圆二色谱法分析α辅肌动蛋白4的二级构象，显示抗dsDNA抗体IgG3与α辅肌动蛋白4结合后，可以改变后者的无规则β-折叠与转角两种二级结构。5）抗dsDNA抗体通过α辅肌动蛋白4促进F-肌动蛋白交联。体外反应体系下低切变率粘度分析和共沉淀实验表明，施加抗dsDNA抗体IgG3-Fab可产生更高的粘滞度和α辅肌动蛋白4/束状肌动蛋白结合比率，其通过改变α辅肌动蛋白4的Ca2+依赖程度，而调节F-肌动蛋白交联。抗dsDNA抗体Fab还可促进系膜细胞高表达束状肌动蛋白和转化生长因子β1。. 本课题揭示了抗dsDNA抗体诱导系膜细胞表型转化的分子机制，为探索治疗狼疮肾脏损害的新途径奠定基础。