p300对Th17细胞RORγt活性的调节机制及其在血吸虫纤维化发生发展的作用

Schistosomiasis is a global public health problem that can not be ignored. Schistosoma egg granuloma caused hepatic fibrosis and its complications are the leading cause of death. Clinical and basic researches have found that Th17 cell plays critical role in autoimmune diseases. RORγt is a key transcription factor to promote the Th17 cell differentiation and proliferation, and RORγt expression, post-translational stability of the state determines Th17 function. A considerable amount of information and the results of our own have confirmed that development of schistosoma granuloma is closely related to IL-17. In the initial experiments we have been also confirmed that, for the first time, acetyltransferase p300 interacts with RORγt in the cell line. p300 mediates and enhances RORγt protein stability and its transcriptional activity. This study will use immunoprecipitation, pull down experiments and luciferase reporter gene technologies to further identify how p300 mediate RORγt post-translational modification, and to investigate molecular mechanisms of p300 interacting with RORγt in Th17 cells in p300 knockout mice and schistosomiasis patients. We want to realize its effect on formation and develoment of schistosoma egg granuloma and liver fibrosis. We expect to finding the key regulatory factor in Th17 cell differentiation in its start of upstream. The results will provide useful experimental data for clinical treatment of fibrosis of schistosomiasis and supply new targets for drug finding.

虫卵肉芽肿导致肝纤维化及其并发症是血吸虫病人死亡主要原因。研究业已发现Th17细胞在肉芽肿形成中所发挥的作用。RORγt是促进Th17分化增殖的关键性转录因子，而RORγt的表达、翻译后修饰状态及其稳定性决定Th17的功能发挥。大量资料以及我们自己的结果已经证实血吸虫肉芽肿的发生发展与IL-17密切相关；我们用细胞系预实验还证实了乙酰转移酶p300可与RORγt相互作用，p300能够介导RORγt蛋白的稳定性并增强其转录活性。本研究将用免疫共沉淀、pull down实验和荧光素酶报告基因等技术，通过细胞系、病人Th17细胞、目的基因敲除鼠等实验，明确p300介导RORγt翻译后乙酰化抑或泛素化修饰的调节作用方式，以及p300作用RORγt对血吸虫虫卵导致肉芽肿及肝纤维化形成的影响及其机制，在Th17细胞分化起始的上游寻找关键调节因子，为临床治疗血吸虫病及纤维化的新药提供靶点及相关实验依据。

项目背景和主要研究内容.血吸虫病的病理基本反应就是沉积在肝脏或肠壁组织的血吸虫虫卵引起的肉芽肿炎症及纤维化，其并发症是病人死亡的原因之一。我们前期的实验结果证实小鼠血吸虫感染后利用IL-17中和抗体可明显降低肝脏肉芽肿的炎症反应，阻断IL-17信号通路后可显著减轻血吸虫感染后脏器的纤维化程度。维甲酸相关孤儿受体（RORγt）是Th17细胞分化时的关键转录因子，直接关系到IL-17的转录激活。然而迄今为止，RORγt自身如何调节及调节机制并不完全清楚。本项目在质谱分析发现具有组蛋白乙酰转移酶活性的p300可与RORγt相互作用基础上，阐明p300可与RORγt相互作用的机制及对Th17细胞功能的作用。.主要研究成果、关键数据及科学意义.主要研究结果证实p300可与RORγt相互作用，并在其81位赖氨酸位置乙酰化 RORγt。在Th17细胞中消减p300的表达后，可下调RORγt蛋白以及RORγt介导的IL-17基因表达，结果说明p300能稳定和促进 RORγt介导的转录活性。.JQ1（p300蛋白特异性小分子化合物抑制剂）处理诱导生成的人Th17细胞，可抑制Th17细胞关键转录因子RORγt的乙酰化，其分泌的IL-17蛋白水平也明显降低；荧光定量PCR结果显示用JQ1处理后，与Th17细胞相关炎症因子的基因水平，如IL-17F, IL-22, IL-21和GM-CSF也明显减少。 .动物实验还证实抑制p300可明显抑制血吸虫虫卵导致肝脏纤维化的形成。小鼠感染血吸虫后6周（此时肝脏纤维化开始形成），先用吡喹酮杀虫，再给予JQ1 50mg/只腹腔注射法处理，连续治疗15天后，与溶剂对照组小鼠比较，观察到JQ1处理组小鼠血清肝功能指标ALT和AST降低，肝脏胶原沉积程度也明显降低，纤维化程度减轻；JQ1处理组小鼠肝脏Th17细胞数量和比例明显降低，肝脏组织检测Th17细胞分泌的相关细胞因子显著抑制。.本项目研究首次阐明了p300对Th17细胞RORγt活性的调节机制，即通过乙酰化Th17细胞关键转录因子RORγt，继而使Th17细胞进一步活化，分泌促炎因子IL-17等。通过抑制p300乙酰化转移酶活性，可抑制Th17细胞活性以及其促炎作用，对与Th17细胞相关的自身免疫性疾病的治疗，包括对抑制血吸虫虫卵导致的肉芽肿和脏器纤维化的发生发展提供新的药物标靶。