QuikChangeTM定点突变中具有同源末端线性DNA分子形成机制的研究

QuikChangeTM site-directed mutagenesis is a widely used site-directed mutagenesis method. It is proved that the success of this method is dependent of linear DNA molecule with homologous ends. However its fomation mechanism is not clear. In a further study, we found that the mechanism is related with strand displacement of DNA polymerase or DNA dissociation. But the strand displacement of DNA polymerases used in QuikChangeTM is not reported. Basing on this point, a QuikChangeTM end product model is used to stimulate the formation of linear DNA molecule with homologous ends, a melting curve analysis method is applied to analyze this model. Then a DNA circular model is establised to analyze the strand displacement of each DNA polymerase. A fast flow-quench system is used for the dynamic analysis of QuikChangeTM end product model. This project will make sure the principle of the QuikChangeTM end product model. The mechanism of the linear DNA molecule with homologous ends formation will be clear. The QuikChangeTM process will be more explicit and it will contribute to the optimization of the QuikChangeTM mechanism.

QuikChangeTM定点突变是当前使用普遍的定点突变技术。我们在前期的研究中证明其依赖具有同源末端线性DNA分子的形成，但是这种DNA分子的形成机制尚不明确，进一步的研究发现这种机制可能和DNA聚合酶具有的链置换活性或DNA链随温度提高发生物理解离有关，而QuikChangeTM定点突变相关DNA聚合酶的链置换活性未见报道。在此基础上，本课题拟使用QuikChangeTM定点突变产物模型模拟具有同源末端线性DNA分子的形成过程，结合荧光定量熔解曲线法对上述模型进行分析；之后建立DNA环形模型，对DNA聚合酶的链置换活性进行测定；再利用快速抑制截流系统对完成QuikChangeTM定点突变产物模型的动态过程进行解析。该课题将可以明确QuikChangeTM定点突变产物模型的机制，探明具有同源末端线性DNA分子的形成原因，明晰QuikChangeTM定点突变的发生过程，进一步完善其机理。

本课题是在修订了QuikChange定点突变机理的基础上工作的延续。在前述工作中，课题负责人发现QuikChange定点突变主要形成的是具有同源末端的线性DNA分子，这种具有同源末端的线性DNA分子在胞内被未知机理的修复机制所修复，环化形成含有突变位点的质粒DNA。本课题进一步研究了具有同源末端的线性DNA在胞内被修复的分子机制。..课题申请人首先排除了现有的同源重组相关蛋白参与的可能性；之后又进一步排除了与此过程类似的DNA修复相关蛋白参与其中。之后课题申请人对核酸外切酶进行了组合敲除，证明核酸外切酶切出单链末端是该过程在细胞内发生的第一步，并进一步推测了QuikChange PCR产物进行DNA修复的体内模型，目前还在进一步确定其他参与的相关蛋白。该工作提出了大肠杆菌细胞进行DNA修复的一种新的机制，对细菌胞内的DNA修复的研究工作具有重要指导作用。..受探明组装过程的启发，课题申请人进一步提出了一种利用核酸外切酶进行体外组装的方法。申请人首先对Gibson组装体系进行了优化，证明只利用T5核酸外切酶放在含有PEG8000的Tris-HCl中就可以发挥组装的作用。之后课题申请人对该体系所涉及的14个因素进行了详细的优化，最终建立了一种简单易行的DNA组装方法-TEDA。该方法的配置成本比现有的已报道的或者商业化的组装成本都要低很多，可以达到3分钱一个反应。我们已经申请了国家专利，也同步申请了国际专利。并且也在合作实验室进行了推广。..我们建立的方法已经对本实验室的课题起到了推动作用，简便了实验室的环境微生物上的工作进度。课题申请人将建立的组装方法应用到了异养细菌硫氧化的生态学意义的研究中，即检验了该方法的实用性，同时也促进了异养细菌硫氧化的生态学意义的研究进展。