哈维弧菌三聚体自转运粘附素对鱼细胞的粘附

Adherence to the host plays a key role in bacterial pathogenesis. Within the diverse group of proteins mediating adhesion, trimeric autotransporter adhesins(TAAs) form a recently discovered and rapidly growing family. They include many medically important pathogenicity factors. Vibrio harveyi(synonym Vibrio carchariea), an economically significant pathogen for the aquaculture industry, have caused severe economic losses in large-scale netcage cultured marine fishes in south China sea, especially in recent years. In aquatic environment, the adherence of V. harveyi in fish may play different pattern from pathogens of human or other mammals. So it is very interesting question whether the difference exsit between V. harveyi and other pathogens reported. The anti- Vh-TAA1 antibody will made to carry out adherence inhibition assays, and a Vh-TAA1 deletion mutant will be constructed to analyze the adherence function of Vh-TAA1 in infection of V. harveyi to fish cells .

三聚体粘附素（TAAs）是新近发现的在革兰氏阴性菌中广泛存在的依附于细胞表面的粘附素，是研究革兰氏阴性细菌与宿主相互作用关系的重要因子。哈维弧菌(鲨鱼弧菌的同物异名)是水产养殖中重要的病原菌，近几年在南海养殖鱼类上的危害日益严重，目前尚未有对该菌的粘附素的研究工作。由于水生动物的特殊性，哈维弧菌对于鱼细胞的粘附可能有别于人及其他哺乳动物，TAAs 在哈维弧菌对鱼侵染中的作用是值得探讨的问题。本项目通过制备哈维弧菌JT2上的三聚体自转运粘附素（Vh-TAA1）抗体来进行粘附抑制试验来分析Vh-TAA1对鱼粘附的作用，通过构建? Vh-TAA1的哈维弧菌分析其在对鱼上皮细胞粘附以及在鱼体攻毒上的粘附及毒力差异，从而确定Vh-TAA1在哈维弧菌对于细胞粘附中的贡献。

哈维弧菌是水产养殖动物重要的病原菌，我们采用基因步移的方法成功获得了哈维弧菌的一个636bp的ORF框，该片段编码212个氨基酸， 经SMART软件分析发现该氨基酸序列就有显著的三聚体自转运粘附素的机构特征，对其预测的同源的C末端的转运区域进行二级机构比对分析，发现其具有一个4个β折叠和一个与其相连的Coiled coil片段，最后经daTAA分析证实我们获得的序列为哈维弧菌的一个三聚体自转运粘附素Vh-TAA。vh-taa基因对温度变化响应不显著（P﹥0.05）；对盐度和铁离子浓度的响应差异显著(P﹤0.05)，在Nacl浓度为40‰时vh-taa表达量最高，在铁离子浓度为1umol/L时vh-taa表达量最高。应用免疫荧光双标记技术，对重组蛋白进行粘附活性实验，激光共聚焦扫描电镜观察，结果显示重组蛋白可以粘附于鲤鱼上皮细胞；重组蛋白及其抗体的粘附抑制试验分别可以显著抑制哈维弧菌对鲤鱼上皮细胞的粘附作用；流式细胞仪进一步证实了重组蛋白对鱼上皮细胞具有粘附活性。通过反复的敲除，大量的结合和重组条件的摸索工作，依然没有能成功获得⊿vh-taa1菌株。这可能是由于vh-taa基因为必须基因，突变株可致死，恢复突变株可存活，即Vh-TAA可能不止具有粘附素的功能，还具有其他重要的未知的生理功能。