RabGDI调节感光细胞内膜蛋白运输机制的研究

Mammalian photoreceptors are specialized cilated cells. The major function of photoreceptors is to convert light signal to electrical signal by the phototransduction pathway. Almost all the proteins involved in the transduction pathway are transmembrane or membrane attached proteins. And these phototransduction proteins are synthesized in inner segments of photoreceptors and transported to the outer segments. Targeting of phototransduction proteins is highly regulated and requires participation of proteins in the Rab GTPases family. RabGDI is a regulating factor of Rab GTPase which locks Rab GTPases in a GDP-bound state and prevents them from association with membrane. There are two GDIs, i.e., GDI1 and GDI2, in human and mouse. The role of GDIs in transport of protein from inner segments to outer segments remains unclear. This application is aimed to ablate the GDI1 or/and GDI2 genes in mouse photoreceptors and investigate the function of GDI1 and GDI2 in photoreceptors. In addition, we plan to isolate MEF cells from these knockout mice and further elucidate the role of GDIs in modulating ciliogenesis and membrane proteins trafficking to cilia.

哺乳动物的感光细胞是一种特化的纤毛细胞，主要功能是把光信号转为神经电信号。参与光信号转导的蛋白大多是膜蛋白，分布在感光细胞的外节段，但它们的合成部位是在内节段。这些蛋白从内节段运输到外节段的过程受严格调控，否则将导致视网膜变性。调节这些蛋白运输的蛋白包括几个Rab 小GTPase家族的几个成员。RabGDI是Rab的调节蛋白，调控Rab蛋白结合GDP的状态以及Rab在细胞体内的分布。人和小鼠都只有两个RabGDI基因，即GDI1和GDI2。对于GDI如何调节感光细胞捏蛋白运输还不清楚。本项目利用基因敲除技术，研究缺失GDI1或GDI2或者同时缺失GDI1和GDI2对感光细胞功能以及胞内蛋白运输的影响，阐明GDI1和GDI2在感光细胞内的生理功能；并且将从GDI基因缺陷的小鼠中分离出MEF细胞，进一步探索GDI对纤毛生产以及蛋白运输到纤毛的调控。

哺乳动物的感光细胞是一种特化的纤毛细胞，主要功能是把光信号转为神经电信号。参与光信号转导的蛋白大多是膜蛋白，分布在感光细胞的外节段，但它们的合成部位是在内节段。这些蛋白在主要通过鞭毛内运输机制从内节段运输到外节段。感光细胞内的蛋白运输机制复杂，运输过程受严格调控，否则将会导致视网膜变性。近来体外的生化实验表明，Rab GTPase，包括几个Rab GTPase家族的几个成员，可能参与调节感光细胞内是紫红质的运输。视紫红质是视杆细胞外节段丰度最高的蛋白，占外节段总蛋白的近90%左右。视紫红质的运输异常也会导致视网膜变性。RabGDI是Rab的调节蛋白，RabGDI可以与结合GDP形式的Rab结合，使Rab蛋白锁定非活性的与GDP结合的状态，并阻止Rab蛋白与生物膜结合，调控Rab在细胞体内的分布。小鼠表达60多种Rab蛋白，但只有两种GDI，即GDI1和GDI2，表明它们具有重要的作用。本项目的目的是为了探索RabGDI调节感光细胞捏膜蛋白运输的机制。在本项目实施中，我们按项目计划构建了Rab GDI1的全身敲除，经表型分析表明GDI1敲除的小鼠视网膜功能正常，也不影响感光细胞内蛋白的表达和分布，表明GDI1对感光细胞的功能非必需。接着我们又构建了 GDI2基因全身敲除的小鼠，但GDI2基因全身敲除是致死的，表明GDI2基因对小鼠胚胎的发育很重要。为了解决致死的问题，我们采用条件性敲除的办法构建了视网膜特异的GDI2基因敲除小鼠。我们对这种小鼠进行系统表型研究。结果表明：GDI2基因敲除的视网膜内，视紫红质表达增加，并积累在感光细胞的外节段，而其他蛋白的表达和运输没有受到明显的影响；高尔基体的形态出现部分异常；小鼠视网膜的暗视野反应受损，而光反应完全正常；视网膜发生缓慢变性。这些结果说明GDI2对视杆细胞内视紫红质的运输起关键调节作用。本项目的完成促进了我们对感光细胞内膜蛋白运输以及视网膜变性机制的理解。