WWP2通过Beclin1介导的自噬促进肺癌发生发展的机制研究

While the incidence and mortality of lung cancer rank the first in all cancers in China, the pathogenesis mechanism of lung cancer has not been elucidated. Our previous study found that WWP2 was highly expressed in lung cancer tissues and cell lines, and was closely related to the poor prognosis of lung cancer patients. Stably silence WWP2 expression by shRNA inhibited lung cancer cell proliferation, arrested cell cycle, increased apoptosis, and blocked EMT. Knockdown of WWP2 expression also inhibited autophagy in lung cancer cells with association of reduced expression of the key autophagy factor Beclin1. WWP2 was also involved in the regulation of serum-starvation-induced autophagy and lung cancer cell survival. Therefore, we hypothesize that WWP2 promotes lung cancer development through Beclin1-mediated autophagy. By using cell culture, nude mouse models and clinical specimens, we will study the role and mechanism of WWP2 in promoting the development of lung cancer, focusing on the how WWP2 regulates autophagy in lung cancer. This study will elucidate the molecular mechanism by which WWP2 promotes lung cancer development and lay a theoretical foundation for the diagnosis and targeted therapy of lung cancer.

肺癌发病率和死亡率均居我国各类肿瘤首位，但其发病机制尚未阐明。我们前期研究发现WWP2在肺癌组织和细胞系中高表达，且与肺癌患者不良预后密切相关。利用shRNA转染稳定沉默WWP2的表达抑制肺癌细胞增殖、阻滞细胞周期、增加细胞凋亡、阻断EMT。敲低WWP2的表达还抑制肺癌细胞自噬活性，同时降低调控自噬活化的关键因子Beclin1的表达，WWP2还参与调控血清饥饿诱导的自噬，促进肺癌细胞存活。因此我们推测：WWP2可能通过Beclin1介导的自噬促进肺癌发生发展。我们拟利用细胞和裸鼠模型以及临床标本研究WWP2促进肺癌发生发展的机制，重点研究WWP2调节Beclin1表达进而调控自噬活性及其在肺癌发生发展中的作用和机制。本研究从分子、细胞、动物模型和临床标本多角度探讨WWP2通过Beclin1调控自噬的分子机制及其在肺癌发生发展中的作用，有望丰富自噬调控机制，为肺癌诊断和靶向治疗奠定理论基础。

肺癌特别是非小细胞肺癌发病率和致死率均高居首位，但其发病机制尚不完全清楚。E3泛素连接酶WWP2属于HECT家族，该家族WWP1、ITCH等在多种类型肿瘤发病及治疗中发挥重要作用，但WWP2在肿瘤特别是肺癌中的作用还有待深入研究。本课题发现WWP2在肺癌组织和细胞系中高表达，并与肺癌患者不良预后相关。利用shRNA慢病毒转染敲低WWP2表达显著抑制肺癌细胞增殖和迁移，阻滞细胞周期，增加细胞凋亡，抑制WWP2表达阻断上皮间质转化过程，上调E-cadherin表达，下调MMP9和Vimentin表达。机制研究发现敲低WWP2表达显著抑制肺癌细胞自噬活性，并下调关键的自噬调控蛋白Beclin1的表达。肺癌细胞内过表达WWP2显著上调Beclin1表达。Co-IP结果提示WWP2可能与Beclin1存在相互作用，WWP2还与LC3相互结合。免疫荧光结果表明肺癌细胞内WWP2与Beclin1存在共定位。血清饥饿和厄尔斯缓冲液（诱导自噬）显著上调WWP2的表达，自噬抑制剂氯喹并不能逆转血清饥饿诱导的自噬。JNK和ERK在血清饥饿诱导的自噬过程中发挥重要作用，阻断JNK和ERK可逆转血清饥饿诱导的WWP2表达上调，提示WWP2的表达调控可能与JNK和ERK通路相关。组织芯片结果表明WWP2与Beclin1、LC3表达正相关，进一步提示WWP2可能通过Beclin1调控肺癌细胞自噬活性。免疫沉淀-质谱联用分析发现WWP2可能与SQSTM1、HSPB1等自噬调控蛋白结合。课题组还发现抑制WWP2表达促进PTEN表达，同时下调其下游Akt通路活性，然而几乎不影响MAPKs（JNK、ERK、p38）通路活性。此外，一线化疗药物顺铂显著上调肺癌细胞内WWP2的表达，敲低WWP2表达显著增强顺铂诱导的抗肿瘤活性。利用Ubibrowser网站预测相互作用蛋白RIPK1可能是WWP2的潜在底物，我们发现敲低WWP2表达显著下调RIPK1的表达，免疫荧光结果显示肺癌细胞内WWP2与RIPK1存在共定位。本课题结果初步阐明WWP2与Beclin1结合从而调控自噬活性促进肺癌发生发展的分子机制，为非小细胞肺癌诊断及治疗提供了新的靶点。