金银花主要药用成分合成积累的生理机制及其药材质量快速评价体系构建研究

Lonicera japonica Thunb. has high medicinal value and widespread application fields, however, its plant source is complicated, variety is confused, and the quality of medicinal material is irregular. Research on physiological mechanism of the biosynthesis and accumulation of main effective components remains limited, and operative methods for quality control is insufficient in production, respectively. An efficient and appropriate utilization of L. japonica is therefore significantly restricted by the issues mentioned above. To address these issues, this project plan to carry out creative researches as follows: (1) Analyze the cytological mechanism of synthesis, transport and accumulation of main components during floral organ development of L. japonica by means of histochemistry and immunocytochemistry; (2) Investigate the dynamic accumulation of main components and its relationship with the expression quantity of key enzyme-encoding genes, also the enzymatic activity downstream during floral organ development of L. japonica using phytochemistry, physiology and molecular biology methods; (3) Detect the fingerprints of chemical composition from Lonicera sources using ATR-FTIR, LC-MS, and HPLC-DAD etc. Meanwhile, a rapid mathematical identification model for quality assessment of Lonicera resources will be built in combination with modern chemometrics. Our results will systematically interpret the biosynthesis mechanisms of main components from physiological, biochemical, subcellular and molecular level. Moreover, a system for quality assessment of Lonicera sources will be built. Ultimately, these achievements will provide efficient techniques for improvement of varieties, rational recovery, and quality control of medicinal materials of Lonicera resources.

金银花有较高药用价值和广泛的应用领域，但是，其植物来源复杂，品种混乱严重，药材质量参差不齐，在生产和交流中缺乏主要有效成分生物合成、积累的生理学机制研究，也缺乏操作性强的质量控制手段，严重制约了金银花的高效、合理利用。为解决这些问题，本课题开展以下研究（1）利用组织化学和免疫细胞化学技术研究金银花花发育过程中主要成分生物合成、转运和积累的细胞学机制研究；（2）运用植物化学、生理学和分子生物学相结合手段研究金银花花器官发育过程中主要成分积累动态及其与调控关键酶活性及相关基因的作用关系；（3）利用ATR-FTIR和LC-MS及HPLC-DAD方法测定不同来源金银花及其易混淆种的化学成分指纹图谱，建立药材质量快速鉴定的数学识别模型。研究结果将从生理生化、亚细胞及分子水平系统阐述金银花主要成分生物合成机制并构建药材质量的快速鉴定体系，为金银花品种改良、合理采收及利用及药材质量控制提供有效技术手段。

金银花有较高的药用价值，但品种混淆严重，采收时期混乱。为解决这些问题，本项目运用植物化学、生理学和分子生物学手段研究金银花花器官发育过程中绿原酸和木犀草苷积累动态规律和调控机制。同时，系统开展了不同来源金银花药材质量评价研究。.（1）本研究研究表明绿原酸和木犀草苷含量和相对产量均在金银花发育的S3阶段最高。抗氧化能力结果进一步显示金银花发育早期（花蕾阶段）抗氧化能力明显高于开花后阶段，因此，我们建议金银花在S3（二白期）采收。另外，结合分子生物学和生理生化的研究手段揭示绿原酸的合成在转录和转录后蛋白水平均受HQT酶调控，木犀草苷的合成受FNS1和FNS2调控，黄酮类成分合成受CHS2，CHI1调控，并且与CHI酶活力的变化规律密切相关。本研究结果为金银花合理利用及质量控制提供了化学、分子技术手段，同时为金银花的高产栽培及品种改良等均提供了理论依据。（2）运用HPLC技术测定分析显示，不同发育阶段四倍体金银花中绿原酸和木犀草苷相对产量以及抗氧化能力均明显高于二倍体，并且抗氧化能力与绿原酸和木犀草苷成分密切相关，因此，诱导同源四倍体金银花可以使其生物量和活性成分含量均能得到大幅度提高，具有较高的药用价值和应用前景。（3）利用原位杂交、免疫组化及荧光组织化学定位方法也同样揭示出HQT基因和HQT蛋白在组织和细胞中的特异表达直接调控了绿原酸的合成和分布。利用多克隆HQT抗体胶体金和漆酶胶体金方法揭示出绿原酸主要在叶绿体和细胞质中合成。细胞质中的绿原酸首先聚集在特化的小泡中，然后通过含有绿原酸的小泡与中央大液泡融合将绿原酸转移至液泡中储存。叶绿体中合成的绿原酸则通过破毁的质体膜与液泡膜直接融合的方式转移至液泡中储存。（4）本研究利用ATR-FTIR，HPLC- DAD技术结合PCA和聚类分析方法对金银花及其近缘种植物化学成分进行了指认，能够快速鉴定出不同测试样品化学成分红外指纹图谱的差异性，实现金银花与其近缘种的快速鉴别。