Wnt10b与PTEN影响BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的关系研究

BMP9 is one of the most potent osteogenic factors to induce osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells (MSCs). Hence, BMP9 is a promising factor for bone tissue engineering to treat the bone related disease. However, our previous studies demonstrated that there are still some defects in BMP9 induced bone formation, such as too much adipocytes in BMP9 induced bone mass, the strength is not so strong at the early stage,and too long for the bone mature, which will directly attenuate the clinical usage of BMP9.Therefor, it’s necessary to enhance the quanlity of BMP9 induced bone formation, and shorten the time needed for bone mature. Our previous investigation indicated that BMP9 can down-regulate the expression of PTEN in MSCs, and inhibition of PTEN can promote BMP9 induced osteogenic differentiation, while exogenous expression of PTEN can greatly inhibit BMP9 induced osteogenesis.Further analysis indicated that BMP9 can up-regulate the expression of Wnt10b,and the BMP9 induced expression of Wnt10b can be enhanced if inhibit PTEN at the same time.With immunodepletion analysis, we found that the use of Wnt10b antibody could substantially inhibit the alkaline phosphatase induced by BMP9 in MSCs.Hence, we make a hypothesis that Wnt10b may be very important for BMP9 to induce osteogenic differentiation in MSCs,and PTEN may affect BMP9 induced osteogenic differentiation through regulating the expression of PTEN.In this project, we will introduce adenovirus mediated over-expression or siRNA interference, and knockout technic, as well as a serial of well establised assay methods to demonstrate the effect of Wnt10b on BMP9 induced osteogenic differentiation, clarify the correlation between PTEN and the effect of Wnt10b on BMP9 induced osteogenesis, and decipher the possible mechanism through which PTEN regulate the expression of Wnt10b in MSCs.

骨形态蛋白9(BMP9)是诱导间充质干细胞（MSCs）成骨分化能力最强的因子之一，具有很好的临床应用前景。但BMP9诱导的成骨分化仍存在不足，有待进一步提高。课题组前期结果显示，BMP9在MSCs中能抑制PTEN表达，并且抑制PTEN能促进BMP9诱导MSCs成骨分化，过表达PTEN则抑制BMP9的这种作用；同时，BMP9促进Wnt10b表达，抑制PTEN可促进BMP9诱导Wnt10b表达，免疫耗竭Wnt10b明显抑制BMP9诱导MSCs碱性磷酸酶活性增加。因此，课题组推测：Wnt10b对BMP9诱导MSCs成骨分化有促进作用，PTEN可通过调节Wnt10b的表达影响BMP9诱导MSCs成骨分化。本课题拟利用过表达、siRNA干扰和基因敲除等多种技术和方法，阐明Wnt10b对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响，以及这种影响与PTEN的关系，并分析PTEN调节Wnt10b表达的可能分子机制。

前期研究结果显示，COX-2可明显参与调节BMP9诱导的间充质干细胞成骨化，但机制不详。在上一项目的支持下，我们证实COX-2对BMP9成骨分化诱导功能的影响可能与其调节PTEN的表达，影响PI3K/Akt信号的活性，进而增强Wnt/β-catenin信号转导有关。但迄今为止，尚不清楚PTEN是否还可通过其他途径实现对Wnt/β-catenin信号的调节。本项目研究证实，BMP9在多能干细胞中可促进Wnt10b表达，沉默Wnt10b抑制BMP9的成骨分化诱导功能；过表达Wnt10b明显促进BMP9的这种作用，机制可能与Wnt10b促进BMP/Smad信号转导和抑制间充质干细胞脂肪分化有关。同时，COX-2可通过CREB途径参与BMP9共同调节Wnt10b的表达。沉默PTEN促进BMP9的成骨分化诱导功能，但这种作用可被沉默Wnt10b取消；同时，过表PTEN抑制BMP9的成骨分化诱导功能，但过表达Wnt10b也能取消PTEN的这种作用。即PTEN可能通过调节Wnt10b表达实现其对骨代谢的调节功能。进一步分析表明，PTEN可通过mTOR/CREB途径，与BMP/Smad信号Cross-talk，共同调节Wnt10b表达。该研究表明，Wnt/β-catenin信号是PTEN的重要靶点之一，但PTEN调节该信号可能并不只是通过影响GSK3β的活性，还可直接通过影响Wnt蛋白表达的方式调节该信号。此外，课题组还发现COX-2可以调节Wnt11表达而影响BMP9的成骨分化。因此，COX-2对骨代谢的影响与Wnt信号关系密切。COX-2抑制剂作为镇痛剂在临床应用较广，因此长期使用可能对影响骨代谢具有潜在的不良影响。课题组进一步研究表明，COX-2抑制剂对骨代谢的影响可被全反式维甲酸逆转，机制同样与促进Wnt/β-catenin信号的活性有关。本研究还发现高磷明显诱导COX-2和BMP9表达，COX-2抑制剂对于血管钙化具有明显抑制作用，并且抑制ALK2也明显减弱高磷所诱导的血管钙化。在血管平滑肌细胞中，高磷可能通过诱导COX-2进而促进BMP9表达。研究结果对于深入了解COX-2的生理功能具有重要意义，同时也为临床扩大COX-2抑制剂的使用范围提供理论和实验依据，具有重要临床意义。