抗氧化低密度脂蛋白人源单链抗体的筛选及其抗动脉粥样硬化研究

OxLDL is the key factor in inducing atherosclerosis and accumulated in atherosclerotic plaque. Specific antibodies could block the binding between oxLDL and receptors of macrophages, and attenuate inflammation and atherosclerosis. In the previous study, we generated a phage display scFv library based on peripheral blood samples of atherosclerosis patients. We isolated specific scFv antibodies from this library against human atherosclerotic plaque tissue. We assumed that these scFv antibodies bind to the oxidation specific epitopes of oxLDL, and play the protective role against atherosclerosis. The experiments in this project are as following: (1) evaluating the ability of scFv based recombinant antibody inhibiting the process of atherosclerosis; (2) examining the inhibiting ability of scFv to foam cells and inflammation; (3) generating transgenic mouse expressing scFv, and observing the atherosclerotic inflammation, uptake of oxLDL by macrophage, formation of atherosclerotic lesion and transcriptome of macrophage. The results of this project will illuminate the mechanism of the inhibition of atherosclerosis by scFv, and provide new sights in the diagnosing and therapy of atherosclerosis.

动脉粥样硬化（AS）是威胁人类健康的重大慢性疾病。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）是AS初期阶段的关键因素，如何抑制其对血管的损伤，是现今面临的重要科学问题。我们拟聚焦AS免疫炎症反应的干预机制，运用免疫学新技术，开发特异性单链抗体（scFv），阻断oxLDL介导的免疫炎症反应，探索干预AS发生发展的新机制。在研究中，我们建立了噬菌体展示人源单链抗体库，发现了抗oxLDL的scFv抗体。我们推测该scFv抗体结合oxLDL氧化特异性表位，具有阻断巨噬细胞摄取oxLDL、抑制炎症损伤、调控细胞脂质转运的作用。本课题拟开展：（1）利用基于scFv的重组抗体分子研究对AS的干预机制；（2）在细胞水平上研究单链抗体抑制炎症损伤和泡沫细胞形成的机制；（3）运用scFv转基因小鼠，研究scFv在炎症反应、巨噬细胞摄取调控以及斑块形成中的作用机制和分子机理。本项目的开展将为AS的早期防治提供新的途径。

在动脉粥样硬化发生发展过程中，脂质过氧化形成的氧化特异性表位（Oxidation-specific epitopes, OSE）广泛分布于动脉粥样硬化斑块部位，并且能够被巨噬细胞表面的清道夫受体、TLRs受体等识别并吞噬，激活巨噬细胞炎症信号通路，改变巨噬细胞的代谢模式，导致巨噬细胞向M1型极化，进一步促进炎症反应和泡沫细胞形成，从而加速动脉粥样硬化的发展。OSE抗原能够引起机体的先天性免疫和获得性免疫反应，机体产生的针对OSE抗原的抗体对动脉粥样硬化的诊断和治疗具有重要的意义。. 本研究首先从冠心病患者的外周血中分离了淋巴细胞，从中克隆了编码抗体的重链和轻链可变区基因序列。利用噬菌体展示技术（phage display），构建了人源单链抗体（single-chain variable fragment antibody）噬菌体展示库，成功筛选到靶向动脉粥样硬化斑块的单链抗体ASA6。. 该抗体能够结合Ox-LDL和动脉粥样硬化病人血管上的斑块病变部位。此外，ASA6还具有对动脉粥样硬化的治疗潜力。体外实验表明ASA6抗体可以有效阻断巨噬细胞对Ox-LDL的吞噬，并抑制Ox-LDL引起的细胞凋亡。小鼠体内实验表明，抗体治疗组小鼠主动脉脂质斑块发生明显少于对照组小鼠。转录组分析表明，ASA6抗体能有效调控PPAR、脂肪酸合成、巨噬细胞分化等重要通路，抑制脂肪过度积累和促进巨噬细胞分化为抗炎性M2型。抗体治疗后小鼠血液总胆固醇、LDL浓度均出现下降，也证明ASA6抗体对脂质代谢的调节作用。这些结果表明ASA6抗体抑制动脉粥样硬化的机制涉及到细胞脂质代谢、炎症信号通路等多个方面。. 为了实现动脉粥样硬化斑块的精准影像检测，我们构建了同时具有近红外二区光学成像和核磁共振成像功能的NaNdF4@NaGdF4纳米探针，然后将其与ASA6进行偶联。偶联后的ASA6-NaNdF4@NaGdF4纳米探针具有优异的靶向性和生物相容性。动物模型实验表明，采用近红外二区成像和核磁共振成像可以清晰观察到小鼠在主动脉弓部、心脏冠状动脉、肝动脉和肾动脉的病变位置。综上所述，本项目证明了ASA6抗体、ASA6-NaNdF4@NaGdF4探针在动脉粥样硬化成像和治疗领域具有良好的应用前景。