转基因芦竹修复水环境磷污染的研究

本研究选用优良水陆两生植物芦竹作为外植体，通过转入聚磷激酶基因(PPK)得到转基因芦竹修复水体富营养化污染。转基因芦竹治理污染时将磷大量富集于体内，从而把水体中磷的含量降低到合理水平。磷是水体富营养化限制因子，磷的治理将使水体富营养化问题得到解决。研究首先从大肠杆菌（E.coil） DH5α中克隆PPK 基因，转入农杆菌LBA 4404后，在进一步完善芦竹组培体系的基础上进行转基因工作。转基因过程中，对影响芦竹转基因的关键因子芦竹外植体的预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间等进行研究，最终得到转 PPK 基因芦竹。转基因芦竹经过鉴定、筛选及磷富集实验后，稳定高效表达的转基因植株将进行富营养化水体磷污染修复。项目实施不但对磷污染起到治理作用，而且对其它污染物的去除将起到很好的借鉴和推动作用。

项目整体进展符合预期，完成了项目计划书规定内容，取得了如下成果。①建立了芦竹离体再生体系：以南太湖优良实生芦竹为材料，进行芦竹组培体系的建立。通过在不同生长时期及不同生长部位取材，实验得出芦竹组培最适外植体为腋芽组织。以腋芽为外植体、MS为基本培养基，分别研究了6-BA和IBA、NAA及2,4-D等不同浓度及组合对离体再生的影响。结果显示BA 5 mg/L﹢IBA 0.5 mg/L为诱导芽丛再生最佳激素组合。5.0 mg/L 2,4-D可以诱导胚性愈伤组织再生。胚性愈伤组织在继代培养后，通过在芽丛诱导培养基上诱导，可以再生芦竹植株。通过以上研究工作，顺利完成了芦竹无菌离体培养最适外植体、培养基和植物生长调节物质的筛选与确定。在芦竹离体再生体系初步建立的基础上，进一步研究了芦竹组培芽体生根、壮苗、驯化及移栽，得到了组培苗生根的最佳激素，以及壮苗、驯化和移栽等方面的最佳条件。研究工作顺利完成了芦竹离体培养细胞高效再生芦竹体系的研究。②建立了农杆菌介导的芦竹转基因体系：农杆菌介导的芦竹转基因过程中各种影响因子的研究，包括最适筛选抗生素、抑菌抗生素、转化促进剂乙酰丁香酮及渗透剂的最佳使用浓度、预培养、浸染、共培养、前培养等条件的筛选与确定。顺利完成了农杆菌介导的芦竹转基因过程中各种影响因子的研究，建立了芦竹转基因体系。③高效富磷转基因芦竹的获得及水体污染修复：通过对细菌、真菌菌株的筛选及基因克隆条件的研究，本项目从大肠杆菌株系 DH-5α中成功克隆得到富集磷（PPK）基因。通过对pCAMBIA 1302载体序列的研究，在合适的位点将PPK基因插入载体上，经过鉴定，序列符合预期设计。成功构建了pCAMBIA 1302-PPK植物表达载体。芦竹为单子叶植物，转基因过程较难。本研究综合分析前期各影响因子，通过对过程条件的不断调整和研究，最终获得了转基因植株。通过在抗性培养基上筛选与鉴定，转基因芦竹得到确认。从太湖支流苕溪河下游取水样，对富营养化状态进行确认后在实验室水箱中进行了芦竹对于富营养化关键因子磷的污染修复及对蓝藻和水体细菌、真菌以及放线菌生长的影响研究。结果表明，芦竹对富营养化磷污染能够起到一定的修复，并且能够影响到水体微生物。转化子显著增强了8.5%磷污染修复能力，修复研究取得预期成果。④ 目前为止已经顺利申请发明专利2项，获得其它专利2项。⑤ 在国内外发表了多篇论文。