茶园土壤Pseudomonas putida CT25菌株咖啡因降解相关基因簇克隆及功能解析

本项目以茶园土壤中分离获得的能高效降解咖啡因的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CT25菌株为材料，通过CT25菌株基因组DNA不完全酶切和文库构建，经含咖啡因培养基筛选培养，获具有咖啡因降解功能的重组转化子；对重组转化子的插入序列进行测序，获CT25菌株咖啡因降解相关基因簇；对基因簇中可能的开放阅读框进行亚克隆和原核表达，研究亚克隆重组转化子表达产物的催化特性，明确基因簇中各开放阅读框的基因功能和对应的咖啡因降解步骤；分析不同条件对咖啡因降解相关酶活性的影响，探明咖啡因降解酶类最佳的反应条件。为可在茶多酚粗品脱咖啡因技术开发中应用的咖啡因降解工程菌改造和生物反应器构建创造条件，同时也可为利用微生物降解途径进行含咖啡因废弃物的无害化和功能化利用奠定基础。

生物降解途径脱咖啡因是低咖啡因茶产品生产和含咖啡因废弃物无害化处理的重要发展方向之一，但其主要机制尚不明确。为此，本研究开展了P. putida CT25咖啡因降解相关基因簇分离和解析以及甲基黄嘌呤类物质代谢途径鉴定等研究。. 在优化实验条件基础上，构建了插入片段5-8kb的CT25基因组文库（共15208个重组子），并从7250个重组子中筛选到了39个耐2.5g/L咖啡因的克隆；在耐10g/L咖啡因克隆11-14-ban-a11和15-18-ban-d13插入片段中获得了咖啡因降解操纵子，可编码甲基黄嘌呤N-1、N-3和N-7脱甲基酶，以及甲基黄嘌呤脱甲基酶D、乙二醛酶和S-羟甲基谷胱甘肽脱氢酶等蛋白；还在其它27个插入片段中分离到了与咖啡因代谢有关的趋化响应、信号转导和转录调节等基因。. 根据体内外反应中间产物监测，咖啡因主要通过N-脱甲基途径降解，即咖啡因可可碱7-甲基黄嘌呤黄嘌呤尿酸，且N-1脱甲基是该途径限速步骤；茶碱可经N-脱甲基、直接氧化或者先脱甲基再氧化3种途径降解。. 随咖啡因浓度增加菌中~65kDa、~40kDa和~32kDa等蛋白表达量增加，这些条带与根据操纵子ORF推演的甲基黄嘌呤脱甲基酶D、甲基黄嘌呤N-1和N-3脱甲基酶、甲基黄嘌呤N-7脱甲基酶分子量基本一致。低浓度EGCG对胞内酶降解咖啡因活力无显著影响。. 转录组分析显示，2.5g/L咖啡因培养3h后，CT25中与信号转导相关的双组份系统和趋化性体系和鞭毛组装等基因被激活；当时间延长至50h时，CT25中与咖啡因代谢、嘌呤代谢和硫代谢等的相关基因表达也明显上调。. 上述研究基本解决了微生物途径脱咖啡因的核心机理，为茶产品脱咖啡因新技术和含咖啡因废弃物的无害化处理技术开发和应用奠定了基础。. 相关研究发表论文6篇，其中SCI收录3篇，获发明专利1项；培养研究生4名，其中已毕业3名。