无精症公鸡睾丸发育及蛋白质组研究

There are investigation data shows that male and female ratio of Chinese local breeders usually is 1:10, which is one times higher than that of the standard varieties. That is mainly because the higher incidence of aspermia leads to a decrease of average semen volume of flock, and usually aspermia accompanied by no spermatogenesis (azoospermia).This study is based on the earlier transcriptome research of aspermia in Beijing-you chicken. The characteristics of endocrine and microstructure of testes will be analyzed by comparing the sex hormone concentration and testis texture. The spectrum will be determined by iTRAQ among three pairs of normal and azoospermia compatriot rooster testes. The differential expression protein will be compared. The protein spectrum related to proliferate and differentiation and spermatogenesis could be obtained by protein functional annotation. Some key proteins cause the azoospermia and main pathway could be recommended by analyzing of signaling pathways and regulatory networks. Overexpression or RNAi will be adopted to identify two to three kinds of core protein factors. In the end, combining with the previous transcriptome research results, some major genes probably affecting spermatogenesis can be summarized. It is of important theoretical significance and economic value for promoting industrialization and localization of local chicken by elimination of azoospermia individuals to improve the average semen volume of flock.

调查数据显示，中国地方种鸡公母配比一般为1:10，比专门化品种高出1倍，主要因无精症比例高，使平均精液量降低，而无精液常常伴随无精子发生。本研究在前期对北京油鸡无精症睾丸转录组研究基础上，通过比较正常和无精公鸡性激素的浓度变化及睾丸组织学改变，分析无精症个体的内分泌及组织学特征；对3对正常和无精症同胞公鸡睾丸的蛋白质表达谱进行iTRAQ测定，比较其差异蛋白，通过功能注释，获得与精细胞增殖、分化及精子发生相关的蛋白表达谱，通过信号通路及调控网络分析，确定导致鸡无精症的关键蛋白及主要信号通路；针对筛选出的核心蛋白因子及信号通路，利用细胞水平的过表达或RNAi技术，鉴定关键蛋白因子对精细胞分化和增殖的影响，深入鉴定2-3个核心因子及其作用通路；结合前期转录组研究结果，分析影响精子发生的主效基因。该研究对于剔除无精症个体提高平均精液量，促进地方鸡产业化和品种国产化进程具有重要科学意义和实用价值。

地方种公鸡中无精症和弱精症比例较高，降低种公鸡的繁殖性能，影响制种效率。本研究首先通过持续的精子活力性状测定，在北京油鸡Y系群体中筛选出弱精子症和正常对照种公鸡各25只，比较其相关血清激素浓度，睾丸发育特征和组织形态学差异，发现FSH、LH和T三个重要激素水平均不存在显著差异，但弱精症公鸡T激素含量有低于正常公鸡的趋势，人工授精试验结果进一步验证弱精症公鸡精液授精能力显著降低。其次，利用iTRAQ技术对前期结合受精率数据进一步筛选的5个弱精症和3个正常个体的睾丸组织进行表达蛋白质的定性和定量，一共鉴定到4266个蛋白，对iTRAQ定量结果的分析，进行同胞弱精和正常个体睾丸组织蛋白表达相互比较，同时对弱精组与正常组之间也进行比较分析。结果发现，3个同胞对都表达上调的蛋白有GST蛋白，无共同表达下调蛋白。两组之间比较，低弱精症组上调倍数较大的蛋白为AspAT和histone H2A，下调倍数较大的蛋白有DDB2和PTPRG。通过对差异蛋白进行GO和KEGG通路分析，揭示嘌呤和嘧啶的代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、电子传递及氧化磷酸化以及蛋白质的转运等信号通路参与调控精子发生和弱精症形成。最后，对关键候选蛋白SPAG6进行进一步的功能验证研究。通过转录调控因子预测发现SOX5基因是SPAG6的潜在转录调控因子，SOX5和SPAG6的表达趋势与公鸡性成熟和繁殖机能衰退的趋势几乎一致，即性成熟前后和繁殖高峰期表达量较高，在性发育前和生精机能减退时表达量较低。此外，40周龄弱精症公鸡睾丸SOX5和SPAG6的表达量显著低于正常公鸡。在细胞上利用RNAi技术干扰SOX5表达，发现SPAG6的表达量也下降，且细胞的增殖和迁移受到抑制。因此，推测SOX5和SPAG6的表达与公鸡睾丸发育水平和精子活力存在一定的相关，可能在SOX5的调控下，影响精细胞的增殖和迁移，作为精子鞭毛重要组织蛋白，SPAG6可能还参与精子形成后鞭毛的运动，从而影响精子活力。.目前已经发表相关论文3篇，提交发明专利申请1项，参加国际学术会议5人次，培养研究生4名，3篇上述主要研究结果的论文在撰写和投稿中。