胆碱能受体对少突胶质细胞分化和髓鞘形成的调控作用及机制

Our previous study has established a high-throughput screening platform by using micropillar arrays for oligodendroglia differentiation and myelination. Upon screening 1500 compound library, we identified a cluster with seven muscarinic receptor antagonists (MRAs) that can promote the differentiation and myelination of oligodendroglia. We propose that one or multiple of the muscarinic receptor subtypes (M1R-M5R) are the targets of MSAs and also regulate the differentiation of oligodendroglia. The goal of the proposal is to identify the subtype(s) of muscarinic receptors that display as the target(s) of MRAs by utilizing siRNA, knockout mice and in vitro culture system. And investigate the downstream of muscarinic receptor by analyzing the screening data and the antagonists and agonists in the compound library. This project will illustrate the regulatory effects and downstream mechanisms of muscarinic receptors on the differentiation and myelination of oligodendroglia, and may provide new therapeutics for demyelinating diseases.

前期采用高通量纳米微柱阵列技术建立了少突胶质前体细胞(OPCs)分化和髓鞘形成筛选平台，能够定量和高效评估OPCs分化和髓鞘形成。通过筛选，鉴定了以氯马斯汀为代表的七个胆碱能受体拮抗剂(MRA)能够高效促进OPCs分化和形成髓鞘。我们推测OPCs表达的五个胆碱能受体亚型(M1R-M5R)中的一个或多个受体，是MRAs的靶点，同时调控OPCs分化和髓鞘形成。本课题拟采用基因沉默技术，敲基因小鼠等方法，结合离体OPCs培养和在体观察，明确MRAs作用的受体。进一步采用高通量纳米微柱阵平台，结合目前筛选结果，尤其是利用靶向胆碱能受体下游的信号通路分子的激动剂和拮抗剂，明确该胆碱能受体亚型的作用机制及信号通路。本项目的完成将首次阐明胆碱能受体对少突胶质细胞分化和髓鞘形成的调控作用和机制，有望为脱髓鞘疾病的治疗研究提供新的药物靶标。

前期采用高通量纳米微柱阵列（High-throughput Micropillar Arrays）技术建立了少突胶质前体细胞（OPCs）分化和髓鞘形成筛选平台，该平台能够定量和高效评估OPCs分化和髓鞘形成，通过筛选1500种小分子化合物，鉴定了以氯马斯汀（clemastine）为代表的一组共七个胆碱能受体拮抗剂（Muscarinic Receptor antagonist, MRA）能够高效促进OL分化和形成髓鞘。我们推测OPCs表达的五个胆碱能受体亚型（M1R-M5R）中的一个或多个受体，是MRAs的靶点，同时调控OL分化和髓鞘形成。本课题采用条件基因敲除小鼠，荧光标记小鼠基因小鼠，免疫染色、行为学检测等方法，结合离体OPCs培养和在体观察，明确MRAs作用的受体。进一步采用电生理学等方法证明了髓鞘形成对神经功能的影响，尤其是利用靶向胆碱能受体下游的信号通路分子的激动剂和拮抗剂，明确了胆碱能受体1的作用机制，及其下游信号通路。..本项目研究发现以下重要结果：.1、采用基因敲除动物OPC细胞培养等方法，证实了M1R是MRAs-氯马斯叮的作用靶受体，并获得了M1R的条件敲基因小鼠。.2、采用M1R条件敲基因小鼠，采用EAE和缺氧等动物，证明M1R对OPCs分化和OLs髓鞘形成具有重要的调控作用。.3、证明敲除M1R促进髓鞘形成，能够进一步调控突触的形成。..研究结果将以2篇论文形式发表于国内重要期刊上，发表SCI论文2篇，1篇发表在Elife（IF 8.303），1篇发表于Neuron（IF 15.045），参编英文专著一部。同时参加国内神经科学会交流等5次。在该课题资助下，毕业博士研究生2名。本项目的完成将阐明胆碱能受体对少突胶质细胞分化和髓鞘形成的调控作用和机制，有望为脱髓鞘疾病和髓鞘发育不良疾病提供的治疗研究提供药物治疗依据。