VEGF/AKT/eNOS通路在多壁碳纳米管致血管内皮功能障碍中的作用研究

Multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) are the most widely used nano fiber materials. They will be used more extensively in clinic as drug carrier or contrast medium. Bio-toxicity of MWCNTs was subject to more and more attention recently. However, little is known of their interactions with endothelial cells. Our previous experiment indicated that MWCNTs can impair endothelial cell function and down-regulate VEGF in vitro. VEGF/AKT/eNOS pathway plays an important role in regulating endothelial cellular homeostasis. Therefore, we hypothesized that VEGF/AKT/eNOS pathway is a significant mechanism of MWCNTs induced endothelial dysfunction. The present study is designed to reveal their interactions with endothelial cells and the role of different diameters in vitro and in vivo; the effect of MWCNTs on VEGF/AKT/eNOS pathway will be also detected. Overexpression adenovirus and specificity agonists are used to identify the role of VEGF/AKT/eNOS pathway in MWCNTs induced endothelial dysfunction. This study will provide new mechanisms for MWCNTs induced endothelial dysfunction, and also support theoretical basis for the risk assessment and management of MWCNTs.

多壁碳纳米管(MWCNTs)目前应用广泛，将来有望作为药物载体和造影剂应用于临床，所以它是否具有毒性成为关注的焦点。以往的研究主要集中于它的肺毒性，其对血管内皮的影响尚不明确。我们前期观察到MWCNTs损伤内皮细胞功能并抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达。VEGF/Akt/eNOS是经典的维持内皮细胞稳态信号通路，故我们推测VEGF/AKT/eNOS通路可能在MWCNTs致血管内皮损伤中起重要作用。本课题拟通过体内和体外实验进一步确定MWCNTs是否损伤血管内皮细胞功能以及不同直径MWCNTs的损伤程度；明确MWCNTs处理后VEGF/AKT/eNOS通路激活水平；同时，结合过表达腺病毒和特异性激动剂，进一步探讨VEGF/AKT/eNOS通路在MWCNTs致血管内皮损伤中的作用。所得结果可揭示MWCNTs损伤血管内皮功能的新机制，为MWCNTs在生物医药领域应用的安全性评价提供科学依据。

多壁碳纳米管(MWCNTs)是目前应用最广泛的新型纳米材料，其具有出众的生物相容性，所以也用于药物载体、造影剂和生物传感器方面。本课题我们通过体内和体外实验相结合的方式，证明MWCNTs致血管内皮的损伤作用，并进一步探究其毒性作用的分子机制。. 首先我们发现:(1)透射电镜扫描证明MWCNTs能够进入内皮细胞，在胞质中聚集成团;(2)当MWCNTs浓度达到10 μg/mL时，HUVECs的活力即出现显著下降，并具有浓度依赖性;(3)细胞功能实验中，MWCNTs处理过的HUVECs小管形成能力显著下降，划痕实验中的细胞迁移功能也显著下降;(4)尾静脉注射MWCNTs后，肺部病理显示有聚集的MWCNTs;(5)小鼠Matrigel Plug实验显示，给予小鼠10 μg/mL MWCNTs 14天后，实验组的Matrigel Plug模型中血管新生数量明显少于对照组。. 机制研究中我们发现:(1)蛋白芯片分析结果表明，MWCNTs处理组细胞中，包含VEGF在内的血管新生相关蛋白的表达量均较对照组有降低;(2)ELISA结果显示MWCNTs处理组细胞上清中VEGF浓度呈浓度依赖性下降;(3)Western-Blot结果表明，MWCNTs处理组HUVECs AKT、eNOS蛋白表达量显著下降;(4)尾静脉注射MWCNTs后，小鼠血清中VEGF含量显著下降。. 在验证VEGF在MWCNTs致血管内皮损伤中的作用的实验中，我们发现:(1)给予MWCNTs处理组HUVECs重组VEGF，内皮细胞的细胞迁移能力和小管形成能力均得到提高;(2)加入重组VEGF后，MWCNTs处理组中AKT、eNOS表达量显著增加;(3)给予MWCNTs处理组小鼠重组VEGF，构建Matrigel Plug模型发现，新生血管的数量有明显增加。. 我们通过研究，证明了MWCNTs能够降低HUVECs的细胞活力，降低细胞的小管形成能力和细胞迁移能力，降低小鼠血管新生能力，且这一过程是MWCNTs通过下调VEGF表达量实现的。综上认为我们认为在应用多壁碳纳米管时需关注其心血管系统毒性作用。